Dokument: Charakterisierung der potentiellen Effektorproteine CPn0043, CPn0072 und CPn1054 aus Chlamydia pneumoniae

Titel:	Charakterisierung der potentiellen Effektorproteine CPn0043, CPn0072 und CPn1054 aus Chlamydia pneumoniae
Weiterer Titel:	Characterization of the potential effector proteins CPn0043, CPn0072 and CPn1054 from Chlamydia pneumoniae
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=29746
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20140616-092423-1
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	MSc. Vergin, Sandra [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 5,81 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 13.06.2014 / geändert 13.06.2014
Beitragende:	Prof. Dr. Hegemann, J. H. [Betreuer/Doktorvater] Prof. Dr. Lammert, Eckhard [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Chlamydien sind Gram-negative, obligat intrazelluläre Bakterien, die akute und chronische Erkrankungen bei Menschen und Tieren auslösen können. Die bedeutendsten humanpathogenen Erreger sind Chlamydia (C.) trachomatis und C. pneumoniae, aber auch für andere Spezies wie C. psittaci oder C. abortus, die primär Tiere als Wirt haben, ist eine Übertragung auf den Menschen beschrieben worden. Eine Infektion mit C. trachomatis führt in Abhängigkeit vom betreffenden Serovar zu Erkrankungen des Urogenitaltrakts oder zu einer chronischen Bindehautentzündung (Trachom), die bei Nichtbehandlung in einer Erblindung resultieren kann. C. pneumoniae infiziert die Atemwege und löst eine Pneumonie, Bronchitis oder Sinusitis aus. Zudem werden chronische Erkrankungen wie Asthma oder Atherosklerose mit einer C. pneumoniae-Infektion in Verbindung gebracht. Der chlamydiale Entwicklungszyklus läuft vollständig innerhalb der eukaryotischen Wirtszelle ab, wobei die Bakterien über den gesamten Zeitraum hinweg innerhalb einer der Wirtszellmembran entstammenden Vakuole verbleiben, die als Inklusion bezeichnet wird. Durch die Manipulation von Wirtszellprozessen mittels sogenannter Effektorproteine, die ins Wirtszellzytosol sekretiert werden, schaffen die Bakterien eine für ihre Entwicklung optimale Umgebung. Da Chlamydien genetisch nicht manipulierbar sind, stellt die Identifizierung neuer Effektorproteine eine Herausforderung dar. Durch Nutzung des eukaryotischen Modellorganismus Saccharomyces cerevisiae (Bäckerhefe) können beispielsweise chlamydiale Proteine identifiziert werden, welche grundlegende, zwischen der Hefezelle und der Humanzelle konservierte zelluläre Strukturen oder Signalwege beeinflussen und daher zu einem Wachstumsdefekt in Hefe führen. In einem in S. cerevisiae durchgeführten genomweiten Screen nach potentiellen neuen Effektoren konnten im Vorfeld zu dieser Arbeit 47 chlamydiale Proteine identifiziert werden, von denen drei im Rahmen der vorliegenden Dissertation weitergehend charakterisiert wurden. Für das Chlamydia-spezifische, hypothetische Protein CPn0072 konnte unter Nutzung eines polyklonalen Antikörpers zu verschiedenen Infektionszeitpunkten eine Inklusionsmembran-assoziierte Lokalisation beobachtet werden. Dieses Ergebnis bestätigt bioinformatische Vorhersagen, nach denen CPn0072 sekretiert wird und es sich bei dem Protein um ein potentielles Inklusionsmembranprotein (Inc-Protein) handelt. Durch differentielle Permeabilisierung infizierter Zellen zeigte sich, dass CPn0072 von der zytosolischen Seite der Wirtszelle her zugänglich ist, wodurch es potentiell mit Wirtszellproteinen interagieren und eine Effektorfunktion ausüben könnte. Die Suche nach putativen humanen CPn0072-Interaktionspartnern unter Nutzung des Hefe-Zwei-Hybrid Systems und einer humanen cDNA-Bank lieferte vier Kandidaten, u. a. einen putativen Zink-Transporter. Es zeigte sich, dass CPn0072 über seinen Amino-Terminus mit dem Zink-Transporter interagiert. Die biochemische Bestätigung dieser Interaktion steht allerdings noch aus. CPn1054 sowie CPn0043 gehören derselben C. pneumoniae-spezifischen hypothetischen Proteinfamilie mit insgesamt 19 Mitgliedern an und werden bioinformatisch als Inc-Proteine vorhergesagt. CPn1054 konnte in der frühen Infektion assoziiert mit Bakterien detektiert werden, während sich in der späten Infektion die für Inc-Proteine charakteristische Inklusionsmembran-assoziierte Lokalisation zeigte. Diese Beobachtung muss jedoch noch bestätigt werden. Auch CPn1054 ist von der zytosolischen Seite der Wirtszelle aus zugänglich, was für eine Effektorfunktion spricht. Der Versuch, CPn0043 mit einem Peptid-Antikörper in infizierten Zellen zu detektieren, schlug fehl. Die Suche nach humanen CPn1054-Interaktionspartnern mittels eines Hefe-Zwei-Hybrid Screens identifizierte insgesamt 14 Kandidaten. Zwei dieser putativen Interaktionspartner, COPS4 und COPS6, stellen Untereinheiten eines Multiproteinkomplexes namens COP9 Signalosom dar. Diese beiden Kandidaten gingen ebenfalls eine Interaktion mit CPn0043 ein. Die Interaktionen der beiden COP9 Untereinheiten mit CPn1054 bzw. CPn0043 konnten biochemisch verifiziert werden. Im Fall von CPn1054 konnte die mit den beiden Untereinheiten interagierende Domäne auf den Mittelteil des Proteins eingegrenzt werden. Immunfluoreszenz-Analysen ergaben keine eindeutigen Hinweise auf eine Wechselwirkung zwischen Chlamydien und dem COP9 Signalosom. Hingegen zeigten erste biochemische Analysen signifikante Veränderungen in der Expression von vier Untereinheiten des Komplexes im Verlauf einer Chlamydieninfektion, was zukünftig weiter abgeklärt werden muss. Das Proteinniveau von COPS1, COPS6 sowie COPS7 sank ab, während die COPS5-Expression deutlich anstieg. Da das COP9 Signalosom an vielen zellulären Signalwegen beteiligt ist, könnten über eine Beeinflussung dieses Komplexes diverse Abläufe innerhalb der infizierten Wirtszelle manipuliert werden, beispielsweise die Regulation des Proteinabbaus oder die Zellproliferation. Chlamydiae are Gram-negative and obligate intracellular bacteria which can cause mild but also serious infections in animals and humans. Chlamydia (C.) trachomatis and C. pneumoniae are the most important human pathogens among the chlamydiae, although other species like C. psittaci or C. abortus have been reported to be transmissible to humans. A C. trachomatis infection leads to an inflammation of the eye (trachoma) or to urogenital tract diseases, depending on the serovar. C. pneumoniae on the other hand causes pneumonia, bronchitis or sinusitis and has also been linked to chronic diseases like atherosclerosis or asthma. During their strictly intracellular replication cycle chlamydiae reside inside a host membrane-derived vacuole termed the inclusion. By secreting so-called effector proteins into the host cytosol and thereby manipulating host cell functions, the bacteria create a favourable environment allowing their development to proceed. The identification of new chlamydial effector proteins is hampered by the fact that the bacteria are genetically intractable. One approach to circumvent this problem is the use of eukaryotic model organisms like the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Given the fact that many cellular structures and processes are conserved from yeast to human, one can assume that chlamydial proteins affecting yeast growth also cause an effect in human cells and therefore represent possible effector proteins. In a previously conducted genome-wide screen in S. cerevisiae, 47 potential new effector proteins of C. pneumoniae could be identified. Three of these candidates were further characterized in the course of the present work. The Chlamydia-specific hypothetical protein CPn0072 displayed an inclusion membrane-associated localization when detected in the infection via polyclonal antibodies. This is in agreement with bioinformatical predictions stating that CPn0072 is secreted via the Type III secretion system (TTSS) and that it represents a putative inclusion membrane protein (Inc protein). Furthermore, CPn0072 was accessible to antibodies from the cytosolic side of the host cell indicating that it may get in contact with host proteins. A search for possible human CPn0072 interaction partners via a yeast two-hybrid screen yielded four candidates, among them a putative zinc transporter. It could be shown that the interaction with this transporter is mediated by the CPn0072 amino terminus. The interaction awaits biochemical verification. CPn1054 and CPn0043 are both members of the C. pneumoniae-specific hypothetical CPn1054 protein family and each represent a potential Inc protein. By using specific antisera, CPn1054 could be detected in association with bacteria early in the infection, while it displayed an Inc protein-like staining at later time points. This observation awaits verification. Furthermore, part of CPn1054 has been shown to be in contact with the host cytosol indicating an effector function of the protein. Antibodies generated against CPn0043 failed to detect the protein in infected cells. A yeast two-hybrid screen could identify 14 potential human interaction partners of CPn1054. Two of these, COPS4 and COPS6, are subunits of a multiprotein complex designated the COP9 signalosome. Besides the interaction with CPn1054, both subunits also showed an interaction with CPn0043. In the case of CPn1054, the interacting region could be mapped to the central part of the protein. While immunofluorescence analyses did not clearly hint at a connection between chlamydiae and the signalosome, preliminary biochemical analyses detected significant changes in the expression levels of several COP9 subunits during chlamydial infection. The expression levels of COPS1, COPS6 and COPS7 decreased whereas in contrast to that an increased expression of COPS5 could be detected. As the signalosome is a multifunctional complex, the bacteria could manipulate many different processes by interfering with its expression level, like for example protein degradation or the cell cycle.
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Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Funktionelle Genomforschung der Mikroorganismen
Dokument erstellt am:	16.06.2014
Dateien geändert am:	16.06.2014
Promotionsantrag am:	27.05.2013
Datum der Promotion:	15.07.2013