Dokument: Charakterisierung eines neuen Phagen-kodierten Aktin-ähnlichen Proteins und die Funktion des Zweikomponentensystems ChrSA in Corynebacterium glutamicum

Titel:	Charakterisierung eines neuen Phagen-kodierten Aktin-ähnlichen Proteins und die Funktion des Zweikomponentensystems ChrSA in Corynebacterium glutamicum
Weiterer Titel:	Characterization of a novel phage-encoded actin-like protein and the function of the ChrSA two-component system in Corynebacterium glutamicum
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=29655
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20140528-112234-7
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Heyer, Antonia [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 22,92 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 28.05.2014 / geändert 28.05.2014
Beitragende:	Prof. Dr. Frunzke, Julia [Gutachter] Prof. Dr. Wagner, Rolf [Gutachter]
Stichwörter:	C. glutamicum, phage, actin-like protein, two component system
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Genome sequencing has revealed prophages or phage remnants in almost all organisms. However, only a fraction has been characterized to date. Upon infection of a bacterial host, temperate bacteriophages can either follow the lytic response, leading to the assembly of new virions, or the dormant, lysogenic response, in which the phage usually resides integrated into the genome of the host (prophage). In Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, an important industrial amino acid producer, the prophage CGP3 was found to be spontaneously induced in a subpopulation, even in the absence of a specific trigger. However, nothing was known with respect to the stimulus triggering CGP3 induction and the regulatory proteins involved in this process. In this work, CGP3 induction was investigated and a novel prophage-encoded actin-like protein (AlpC) was characterized regarding its role in the phage life cycle. In an independent part of this work, the function of the two-component system (TCS) ChrSA in heme homeostasis in C. glutamicum was unraveled. In the first part of this thesis, it was shown that the induction of the CGP3 prophage is linked to the host SOS response, as it has been reported for several phages. In the case of the model phage lambda of Escherichia coli, CI is the central regulator controlling the stable lysogenic state. In this work, the CGP3-encoded, transcriptional regulator Cg2040 of the Cro/CI family was characterized. EMSA studies and transcriptome analysis demonstrated that Cg2040 binds within the promoter region of cg2040, thereby, repressing its own expression and the transcription of the adjacent genes cg2033-cg2040, encoding mostly hypothetical proteins. However, deletion or overexpression of cg2040 showed no significant influence on CGP3 induction. Therefore, it was proposed that Cg2040 does not represent the central phage repressor of CGP3, but may be involved in the downstream cascade. A major focus of this work was the characterization of the novel actin-like protein Cg1890 (AlpC), which was identified in a phylogenetic study, and is, in fact, encoded by the first open reading frame next to CGP3 attR. A time-resolved transcriptome analysis revealed alpC among the early phage genes, highly induced upon prophage induction. In native concentrations, AlpC polymerizes by ATP/GTP hydrolysis into straight filaments pointing at varying angles to the cell membrane. The co-transcribed gene alpA (cg1891) has been proposed to code for a putative adaptor protein which couples phage DNA to AlpC filaments. EMSA studies revealed that AlpA binds in the promoter region of the operon alpAC (designated as alpS). In vivo, AlpA is often (87%) associated with an AlpC filaments. Thus, a first evidence for interaction of AlpC and AlpA was provided. In fluorescence microscopy studies using a strain with eYFP-labeled phage DNA, CGP3 DNA was detected at AlpC filaments or frequently close to the cell membrane. Deletion of alpC or alpA was shown to have a severe impact on phage DNA replication. Based on these data, a model has been postulated in which AlpC mediates efficient transport of CGP3 DNA to the cell membrane, where phage replication might take place. Previous studies suggested a connection between CGP3 activity and iron homeostasis. Therefore, the function of the TCS ChrSA in heme homeostasis was studied in an independent part of this work. Transcriptome analysis of mutant strains and EMSA studies revealed the divergently located operon hrtBA, encoding a heme-detoxifying ABC transporter, as direct target activated by the response regulator ChrA. Consequently, deletion of chrSA or hrtBA resulted in an increased sensitivity towards heme. Furthermore, these studies revealed that ChrA autoregulates its own expression and, remarkably, represses the expression of the homologous response regulator hrrA. Altogether, the presented results provided evidence for a complex interaction of the TCS HrrSA and ChrSA in heme-dependent gene regulation in C. glutamicum. Durch Genomsequenzierungen konnten Prophagen und Phagenüberreste in fast jedem Organismus identifiziert werden, jedoch wurde bisher nur ein Bruchteil charakterisiert. Bei der Infektion eines Bakterienwirts, können temperente Bakteriophagen den lytischen Weg, der zur Assemblierung neuer Virionen führt, oder den inaktiven, lysogenen Weg verfolgen, bei dem der Phage meist integriert im Genom des Wirts (Prophage) verbleibt. In dem wichtigen Aminosäureproduzenten Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 wurde der Prophage CGP3 in einer Subpopulation auch ohne einen spezifischen Auslöser spontan induziert vorgefunden. Über den Stimulus, der die CGP3 Induktion auslöst, und die an diesem Prozess beteiligten, regulatorischen Proteine war jedoch nichts bekannt. In dieser Arbeit, wurde die CGP3 Induktion untersucht und ein neues Prophagen-kodiertes Aktin-ähnliches Protein (AlpC) bezüglich seiner Funktion im Lebenszyklus des Phagen charakterisiert. In einem unabhängigen Teil dieser Arbeit wurde die Funktion des Zwei-Komponenten Systems (ZKS) ChrSA in der Häm-Homöostase in C. glutamicum aufgeklärt. Im ersten Teil der Arbeit wurde gezeigt, dass die Induktion des Prophagen CGP3 mit der SOS Antwort verlinkt ist, wie es bereits für mehrere Phagen nachgewiesen wurde. Für den Phagen Lambda in Escherichia coli ist CI der zentrale Regulator, der den stabilen lysogenen Status kontrolliert. In dieser Arbeit wurde der CGP3-kodierte, transkriptionelle Regulator Cg2040 aus der Cro/CI Familie charakterisiert. Mittels EMSA Studien und Transkriptom-Analysen wurde gezeigt, dass Cg2040 in der Promotorregion von cg2040 bindet und dadurch seine eigene Expression und die Transkription der benachbarten Gene cg2033-cg2040 reprimiert, die überwiegend hypothetische Proteine kodieren. Allerdings zeigte die Deletion oder Überexpression von cg2040 keinen signifikanten Einfluss auf die CGP3 Induktion. Daher wurde angenommen, dass Cg2040 nicht den zentralen Repressor von CGP3 darstellt, aber in der nachfolgenden Kaskade involviert sein könnte. Ein Schwerpunkt dieser Arbeit war die Charakterisierung des neuen Aktin-ähnlichen Proteins Cg1890 (AlpC), das in einer phylogenetischen Studie identifiziert wurde und durch den ersten offenen Leserahmen hinter CGP3 attR kodiert ist. Eine zeitlich aufgelöste Transkriptomanalyse zeigte, dass alpC zu den frühen Phagengenen gehört und nach der Prophagen Induktion stark induziert ist. AlpC polymerisiert in nativer Konzentration durch ATP/GTP Hydrolyse in gerade Filamente mit unterschiedlicher Ausrichtung zur Zellmembran. Es wurde vermutet, dass das gemeinsam transkribierte Gen alpA (cg1891) ein putatives Adapterprotein kodiert, das die Phagen DNA mit den AlpC Filamenten verbindet. Durch EMSA Studien wurde eine Bindung von AlpA in der Promotorregion des alpAC Operons nachgewiesen (als alpS bezeichnet). AlpA ist in vivo oft (zu 87%) mit einem AlpC Filament assoziiert, was einen ersten Hinweis auf eine Interaktion zwischen AlpC und AlpA darstellt. Eine fluoreszenzmikroskopische Studie, bei der ein Stamm mit eYFP markierter Phagen DNA verwendet wurde, lokalisierte die CGP3 DNA an AlpC Filamenten oder häufig in der Nähe der Zellmembran. Es wurde nachgewiesen, dass die Deletion von alpC oder alpA einen bedeutenden Einfluss auf die Phagen Replikation hat. Aufgrund dieser Daten wurde ein Modell aufgestellt, in dem AlpC den effizienten Transport von CGP3 DNA zur Zellmembran vermittelt, an der die Replikation stattfinden könnte. Vorherige Studien deuteten auf einen Zusammenhang zwischen CGP3 Aktivität und Eisen-Homöostase hin. Daher wurde die Funktion des ZKS ChrSA in der Häm-Homöostase in einem unabhängigen Teil dieser Arbeit untersucht. Durch Transkriptomanalysen von mutierten Stämmen und EMSA Studien wurde das divergent lokalisierte Operon hrtBA, das einen Häm-detoxifizierenden ABC Transporter kodiert, als direktes, durch den Antwortregulator ChrA aktiviertes Ziel identifiziert. Folglich führte die Deletion von chrSA oder hrtBA zu einer erhöhten Häm-Sensitivität. Des Weiteren zeigten diese Experimente, dass ChrA seine eigene Expression autoreguliert und außerdem die Expression des homologen Antwortregulators hrrA reprimiert. Die dargestellten Ergebnisse weisen insgesamt auf eine komplexe Interaktion der ZKS HrrSA und ChrSA in der Häm-abhängigen Genregulation in C. glutamicum hin.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Sonstige Einrichtungen/Externe » Institute in Zusammenarbeit mit der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf » Institut für Biotechnologie, Forschungszentrum Jülich GmbH
Dokument erstellt am:	28.05.2014
Dateien geändert am:	28.05.2014
Promotionsantrag am:	24.05.2013
Datum der Promotion:	08.07.2013