Dokument: Selektion und Charakterisierung spezifischer Bindeproteine für amyloidogene Proteine der Alzheimer-Krankheit

Titel:	Selektion und Charakterisierung spezifischer Bindeproteine für amyloidogene Proteine der Alzheimer-Krankheit
Weiterer Titel:	Selection and Characterization of Binding Proteins Specific for Amyloidogenic Proteins of Alzheimer Disease
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=29605
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20140627-134034-7
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Grüning, Clara [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 15,88 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 22.05.2014 / geändert 22.05.2014
Beitragende:	Dr. Hoyer, Wolfgang [Gutachter] Prof. Dr. Willbold, Dieter [Gutachter]
Stichwörter:	Alzheimer Krankheit, Engineered binding proteins, tau, Abeta, amyloid, aggregation
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Die Alzheimer-Krankheit (AD) ist eine tödlich verlaufende neurologische Krankheit mit weltweit ansteigender Fallzahl. Das Alzheimer-Gehirn ist geprägt von dem Verlust von Neuronen und der Ansammlung von Aggregaten (senile Plaques und neurofibrilläre Bündel) zweier Proteine, dem Amyloid-beta Peptid (Abeta), einem Spaltprodukt des Amyloid-Vorläuferproteins (APP), und dem Mikrotubuli-Bindeprotein tau. Mehrere Anhaltspunkte weisen auf eine neurotoxische Rolle von Intermediaten des Aggregationsprozesses beider Proteine im Verlauf der AD hin. Daher ist die Charakterisierung dieser Intermediate essentiell um die molekularen Prozesse der AD zu verstehen und in sie eingreifen zu können. In den Kapiteln 1 und 2 dieser Dissertation wurden Aggregationsintermediate des Abeta-Peptids charakterisiert. Beide Kapitel bauen auf der Benutzung eines Bindeproteins, des Affibody ZAbeta3, zur Ko-Expression und anschließenden Reinigung von nicht-aggregiertem Abeta aus Bakterien auf. ZAbeta3 ist ein durch eine Disulfidbrücke verbundenes Homodimer, das Abeta durch Abschirmen in einer Tunnel-ähnlichen Vertiefung von der Aggregation abhält. Diese Eigenschaft hat sich, wie in Kapitel 2 gezeigt, auch für die Expression und Reinigung eines kovalent verknüpften Abeta Dimers bewährt. In Kapitel 1 wurde ZAbeta3 durch Einfügen eines Tryptophans an eine Position, die bei Abeta-Bindung strukturellen Veränderungen unterliegt, zu einem fluoreszenten Detektor für monomeres Abeta modifiziert. Diese ZAbeta3-Variante, ZAbeta3W, ermöglichte die spezifische und quantitative Detektion von monomerem Abeta in einem Zerfallsversuch eines Abeta-Aggregationsintermediats mit hohem Molekulargewicht, der Protofibrille. Voraussetzung für die Verfolgung des Zerfalls der Protofibrille in monomere Bestandteile war dabei, dass ZAbeta3W die Rückreaktion der Monomere zur Protofibrille unterband. Die erhaltenen Dissoziationskinetiken entsprechen einem exponentiellen Zerfall mit einer Halbwertszeit von circa zwei Stunden (25°C) und weisen damit auf eine hohe Stabilität der Protofibrille hin. Der exponentielle Zerfall ist nicht vereinbar mit einer Auflösung der Fibrille ausschließlich von den Enden her, sondern weist auf eine Dissoziation von Untereinheiten an jeder Position der Protofibrille hin. In Kapitel 3 wurde aus einer Proteinbibliothek basierend auf ZAbeta3 ein Bindeprotein für tau selektiert, benannt TP4. Auch wenn die Struktur des TP4:tau Komplexes mittels NMR auf Grund des Verschwindens von tau Signalen nach Zugabe von TP4 nicht möglich war, gelang es durch Titrationsexperimente und Prolinmutanten zu zeigen, dass TP4 tau in zwei alternativen Konformationen mit gleicher Häufigkeit bindet. Diese Konformationen enthalten Regionen hoher Sequenzähnlichkeit, die für die Aggregation wichtig sind: PHF6, PHF6* und PHF6**. Konformation 1 enthält PHF6 und PHF6* und Konformation 2 enthält PHF6 und PHF6**. Dass die Aggregation von tau durch TP4 unterbunden werden kann, betont die Bedeutung dieser Sequenzmotive und legt eine Interaktion zwischen den Motiven während der Aggregation von tau nahe. In dieser Dissertation wurden Bindeproteine erfolgreich genutzt um die an der Alzheimer Krankheit beteiligten Proteine, Abeta und tau, strukturell zu untersuchen. Alzheimer disease (AD) is a fatal neurological disorder with increasing case numbers worldwide. The AD brain is characterized by progressive neuronal loss along with protein aggregates, senile plaques and neurofibrillary tangles, built up of two major proteins, namely the amyloid-beta peptide (Abeta), a cleavage product of the amyloid precursor protein, and the microtubule-binding protein tau, respectively. Several lines of evidence suggest a neurotoxic role for aggregation intermediates of Abeta and tau in the course of AD pathogenesis, which emphasize the importance of their characterization to understand and modulate AD progression. Chapter 1 and chapter 2 of this doctoral thesis are dedicated to the characterization of aggregation intermediates of the Abeta peptide. Both chapters rely on an engineered binding protein, the affibody ZAbeta3, as a co-expression agent for purification of non-aggregated Abeta from bacterial expression. ZAbeta3 is a disulfide-linked homodimer that protects Abeta from aggregation by shielding it in a tunnel-like cavity. This feature also proofed successful for the purification of a synthetic covalently-linked Abeta-dimer (chapter 2). Chapter 1 describes the modification of ZAbeta3 to a fluorescent detector of monomeric Abeta by introduction of a tryptophan at a position susceptible to structural changes induced by binding of Abeta. This ZAbeta3-variant, ZAbeta3W, enabled the highly specific and quantitative detection of monomeric Abeta in a dissolution assay of a neurotoxic high molecular weight Abeta aggregation intermediate, the protofibril. ZAbeta3W also impeded the reverse reaction from monomers associating onto the protofibril, a prerequisite for the analysis of the protofibril dissolution. The derived dissociation kinetics of the protofibril followed an exponential decay with a time constant of approximately two hours (25°C), which underlines the high kinetic stability of Abeta protofibrils. The observed exponential decay is not in agreement with a dissociation of monomers only from the protofibrils’ ends, but suggests a dissociation of subunits from all positions of the protofibril. Chapter 3 deals with the selection of a highly specific binding protein for tau, denoted TP4, from a scaffold library based on ZAbeta3. Although elucidation of the TP4:tau complex structure by NMR was impeded by the absence of tau resonance signals in the TP4-bound form, titration experiments and proline mutants of tau demonstrated that two alternative conformations of tau are bound with the same frequency by TP4. These conformations contain regions of high sequence similarity important for tangle formation, PHF6, PHF6* and PHF6**. Conformation 1 encompasses PHF6 and PHF6* and conformation 2 encompasses PHF6 and PHF6**. TP4 inhibits tau aggregation, which underlines the importance of these motifs for tangle formation and suggests an interaction of these motifs in tangle formation. This thesis exemplifies the usage of engineered binding proteins to elucidate structural and mechanistical insights of the amyloidogenic proteins Abeta and tau.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Physikalische Biologie
Dokument erstellt am:	27.06.2014
Dateien geändert am:	27.06.2014
Promotionsantrag am:	11.03.2014
Datum der Promotion:	29.04.2014