Dokument: Metabolic engineering of Corynebacterium glutamicum for production of the adipate precursor 2-oxoadipate

Titel:	Metabolic engineering of Corynebacterium glutamicum for production of the adipate precursor 2-oxoadipate
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=29549
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20140520-094738-4
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Spelberg, Markus [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 7,84 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 18.05.2014 / geändert 18.05.2014
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Adipat ist eine C6-Dicarbonsäure und stellt als Vorstufe für Nylon-6,6 einen der wichtigsten Bausteine in der chemischen Industrie dar. Bisher wird Adipat durch chemische Syntheseverfahren unter Verwendung von gesundheitsschädlichen und umweltbelastenden Reagenzien hergestellt. Daher ist die biotechnologische Produktion von Adipat, basierend auf erneuerbaren Kohlenstoffquellen, von großem Interesse. Vor diesem Hintergrund war das Hauptziel dieser Arbeit die Etablierung der Produktion der Adipatvorstufe 2 Oxoadipat mittels Metabolic Engineering in Corynebacterium glutamicum. Neben der industriellen Verwendung als Produktionsorganismus für Aminosäuren, besitzt C. glutamicum ein hohes Potential für die Produktion von organischen Säuren wie Lactat oder Succinat. Kultivierungsexperimenten ergaben, dass weder Adipat noch 2 Oxoadipat von C. glutamicum verstoffwechselt wird. Auf die Wachstumsrate von C. glutamicum hatte die Zugabe von pH-neutralisierten Adipat- (µ = 0.43 h-1) und 2-Oxoadipat-Lösungen (µ = 0.43 h 1) bis zu Konzentrationen von 50 mM keinen Einfluss. Die Zugabe von 150 mM oder 250 mM Adipat führte zu einer um 37% verminderten Wachstumsrate (µ=0.29 h-1). In Gegenwart von 500 mM Adipat lag hingegen eine fast vollständige Wachstumshemmung von C. glutamicum vor. Eine mit KOH auf pH 7 eingestellte Adipatlösung steigerte die Wachstumsrate bei Zugabe von 500 mM auf µ = 0.09 h-1. Die Zugabe von 5 mM der osmotisch wirksamen Substanz Prolin führte zu einer Wachstumsrate von µ = 0.16 h-1. Diese Ergebnisse sowie DNA-Chip Experimente in Anwesenheit von 50 mM und 150 mM Adipat zeigten, dass die Wachstumshemmung teilweise durch osmotischen Stress bedingt sein kann. Des Weiteren konnte anhand der Transkriptomdaten gezeigt werden, dass als Folge der Adipat-Zugabe der Transkriptionsregulator pcaR als auch dessen Zielgene pcaIJ und pcaFDO, die im β Ketoadipat Stoffwechselweg vorkommen, stark hoch-reguliert waren. Adipat fungiert in C. glutamicum somit wahrscheinlich als Aktivatormolekül des Transkriptionsregulators PcaR. Zur Etablierung der Homocitrat-Produktion ausgehend von 2-Oxoglutarat, wurden die Gene für die Homocitrat-Synthase (HCS) aus Saccharomyces cerevisiae (lys20) und Thermus thermophilus (ttc1550) in C. glutamicum (Plasmid-basiert und chromosomal) etabliert. Die Aktivität der heterologen HCS wurde durch die Produktion von Homocitrat in Standard-Kultivierungsexperimenten mit 222 mM (40 g l-1¬) Glukose nachgewiesen. Dabei produzierte der Stamm C. glutamicum/pEKEx2-lys20 bis zu 2,6 mM (0,54 g l-1) und der Stamm C. glutamicum Δgdh::Ptuf-lys20 (Stamm MS-1) bis zu 4,1 mM (0,83 g l-1) Homocitrat. Zur Steigerung der Produkttiter wurden weitere genetische Modifikationen implementiert sowie die Kultivierungsbedingungen modifiziert. Die Homocitrat-Produktion mit dem Stamm MS-1 (C. glutamicum Δgdh::Ptuf-lys20) konnte unter fed-batch Bedingungen mit anfänglich 222 mM Glukose und zusätzlicher Zugabe von 222 mM Glukose und 204 mM Acetat am Anfang der stationären Phase auf 27,1 mM (5,5 g l-1) gesteigert werden. Die chromosomale Integration einer Pyruvat-Carboxylase (pycP458S), bei gleichzeitiger Deletion der pta-ackA Region, sowie die Expression einer weiteren Plasmid-basierten Genkopie von lys20 (C. glutamicum MS-3-pHCS) führten unter fed-batch Bedingungen zur weiteren Erhöhung der Produktion auf 52,1 mM (10,6 g l-1) Homocitrat. Dies entspricht einer Ausbeute von 0,21 mol CHomocitrat/ mol CGlukose+Acetat. Zur Etablierung der 2-Oxoadipat-Produktion wurden Gene, die für die Homoaconitase (HA) aus S. cerevisiae (lys4) und die Homoisocitrat-Dehydrogenase (HICDH) aus S. cerevisiae (lys12) kodieren in C. glutamicum Plasmid-basiert und chromosomal integriert, eingefügt. Durch die Akkumulation von bis zu 2,3 mM (0,37 g l 1) 2 Oxoadipat mit dem Stamm C. glutamicum/pEKEx2-lys20/pVWEx2-lys4-lys12 und von bis zu 3,5 mM (0,56 g l-1) mit dem Stamm C. glutamicum Δgdh::Ptuf-lys20ΔaceA::Ptuf-lys4-lys12 (MS-5) wurde die Aktivität der heterolog exprimierten HA und HICDH bestätigt. Weiterhin waren diese Ergebnisse ein Beleg für die Fähigkeit von C. glutamicum Homocitrat und 2-Oxoadipat zu exportieren. Die Kultivierung des Stamms C. glutamicum/pEKEx2-ttc1550/pVWEx2-lys4-lys12 führte unter Stickstofflimitierung zur Steigerung der 2 Oxoadipat-Produktion auf 9,1 mM (1,5 g l-1). Mit dem aktuell besten 2 Oxoadipat-Produzenten MS-5-pHCS, welcher sich durch eine weitere Plasmid-basierte Genkopie von lys20 von dem Stamm C. glutamicum MS-5 unterscheidet, wurde 27,1 mM (4,4 g l-1) 2 Oxoadipat produziert. Das entspricht einer Ausbeute von 0,13 mol C2 Oxoadipat/mol CGlukose+Acetat. Die hier präsentierten Ergebnisse zeigen somit zum einen das Potential von C. glutamicum zur Produktion von Homocitrat und 2-Oxoadipat und sind zum anderen die Basis für weitere Untersuchungen zur Umsetzung von 2-Oxoadipat zu Adipat. The C6-dicarboxylic acid adipate is one of the most important building blocks in the chemical industry. The chemical syntheses of adipate are connected to insanitary and environmentally harmful reagents and catalysts. Therefore, the establishment of a biotechnological process for adipate production based on renewable carbon sources is of substantial interest. Thus, the main objective of this work was the metabolic engineering of Corynebacterium glutamicum for the production of the adipate precursor 2 oxoadipate. This organism is an industrially established producer of amino acids, but was also shown to possess a high capability for the production of organic acids, such as lactate or succinate. Neither adipate nor 2-oxoadipate (solutions adjusted to pH 7) were metabolised by C. glutamicum wild type and they did not inhibit growth in glucose minimal medium in concentrations up to 50 mM (µ = 0.43 h-1). Addition of 150 mM or 250 mM adipate resulted in a 37% decreased growth rate (µ = 0.29 h-1), whereas a concentration of 500 mM adipate almost completely abolished growth. When adjusting the pH of the adipate solution with KOH to pH 7, the addition of 500 mM adipate still allowed a growth rate µ of 0.09 h-1. Additional supplementation of 5 mM of the compatible solute L-proline further increased the growth rate to 0.16 h-1. The latter result and DNA microarray experiments performed in the presence of 50 mM and 150 mM adipate indicated that the growth retardation might be caused to some extent by osmotic stress. Furthermore, the transcriptome data revealed high up-regulation of the transcriptional regulator PcaR and its target genes pcaIJ and pcaFDO, belonging to the PCA (protocatechuate) branch of the β-ketoadipate pathway. Thus, adipate probably acts as an activator molecule of PcaR in C. glutamicum. The initial metabolic engineering studies focused on the introduction (plasmid-based or chromosomally) into C. glutamicum of the genes lys20 (Saccharomyces cerevisiae) or ttc1550 (Thermus thermophilus) encoding homocitrate synthase (HCS) for homocitrate production from 2 oxoglutarate. Under standard batch cultivation conditions with 222 mM (40 g l-1) glucose, C. glutamicum/pEKEx2-lys20 and C. glutamicum Δgdh::Ptuf-lys20 (strain MS-1) excreted up to 2.6 mM (0.54 g l-1) and up to 4.1 mM (0.83 g l-1) homocitrate, respectively, showing that the heterologous HCS was active. Further studies focused on the enhancement of the titers of both products by metabolic engineering and by modified culture conditions. In a fed-batch cultivation with initially 222 mM glucose and addition of 222 mM glucose and 204 mM acetate at the beginning of the stationary phase, homocitrate production by strain MS-1 (C. glutamicum Δgdh::Ptuf-lys20) was increased up to 27.1 mM (5.5 g l-1). Chromosomal integration of pycP458S coding for a pyruvate carboxylase into strain MS-1 and simultaneous deletion of pta-ackA in combination with an additional plasmid-based copy of lys20 resulted in the most promising homocitrate producer MS-3-pHCS, which accumulated up to 52.1 mM (10.6 g l-1) homocitrate in fed-batch cultivation with glucose and acetate as an additional carbon source. This titer represents a yield of 0.21 mol Chomocitrate/mol Cglucose+acetate. 2-Oxoadipate production in C. glutamicum was established by introducing (plasmid-based and chromosomally) a homoaconitase (HA, lys4) and a homoisocitrate dehydrogenase (HICDH, lys12) from S. cerevisiae. The resulting strains C. glutamicum/ pEKEx2-lys20/pVWEx2-lys4-lys12 and C. glutamicum Δgdh::Ptuf-lys20ΔaceA::Ptuf-lys4-lys12 (strain MS-5) excreted 2.3 mM (0.37 g l-1) and up to 3.5 mM (0.56 g l-1) 2-oxoadipate, respectively, confirming the activity of the heterologous HA and HICDH. Moreover, these results showed that C. glutamicum has the capability to export both homocitrate and 2 oxoadipate. Cultivation of C. glutamicum/pEKEx2-ttc1550/pVWEx2-lys4-lys12 under nitrogen limitation increased 2-oxoadipate production up to 9.1 mM (1.5 g l-1). The highest 2 oxoadipate titer of 27.1 mM (4.3 g l-1) (0.13 mol C2-oxoadipate/mol Cglucose+acetate) was produced by strain MS-5-pHCS, which differs from strain MS-5 by an additional plasmid-based copy of lys20. The results reported above demonstrate the capability of C. glutamicum for production of homocitrate and 2 oxoadipate and form the basis for further studies directed at conversion of 2-oxoadipate to adipate.
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Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie
Dokument erstellt am:	20.05.2014
Dateien geändert am:	20.05.2014
Promotionsantrag am:	28.10.2013
Datum der Promotion:	05.12.2013