Dokument: Enzymatische Synthese von GDP-ß-L-Fucose ausgehend von D-Mannose: Klonierung, Expression und Charakterisierung von Enzymen aus nicht-pathogenen Enterobacteriaceae

Titel:	Enzymatische Synthese von GDP-ß-L-Fucose ausgehend von D-Mannose: Klonierung, Expression und Charakterisierung von Enzymen aus nicht-pathogenen Enterobacteriaceae
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=2948
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20041006-000948-7
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Weidner, Stefan Georg [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 3,56 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 09.02.2007 / geändert 09.02.2007
Beitragende:	Prof. Dr. Kula, Maria-Regina [Gutachter] Prof. Dr. Ernst, Joachim F. [Gutachter] Prof. Dr. Elling, Lothar [Gutachter]
Stichwörter:	Phosphomannomutase, GDP-Mannose Pyrophosphorylase, GDP-D-Mannose-4,6-Dehydratase, GDP-Fucose Synthetase, GDP-Mannose, GDP-Fucose, Nukleotidzucker, enzymatische Synthese
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibung:	Für die Untersuchung und Manipulation von Kohlenhydrat-Protein-Wechselwirkungen werden zunehmend Oligosaccharidstrukturen in größeren Mengen benötigt. Um derartige Verbindungen enzymatisch herstellen zu können, müssen einerseits Glykosyltransferasen und andererseits deren Substrate, die Nukleotidzucker, in ausreichenden Mengen bereitgestellt werden. Die Etablierung einer enzymatischen Synthese der GDP-Fucose ist aus mehreren Gründen interessant. Zum einen ist dieser aktivierte Zucker, als wichtiger Bestandteil von Glykokonjugaten, für die Forschung auf dem Gebiet der Glykobiologie unerlässlich und zum anderen stellen Nukleotidzucker, allen voran die GDP-Fucose, nach wie vor einen beträchtlichen Kostenfaktor dar, wenn man sie in stöchiometrischen Mengen bei größeren Ansätzen einsetzen will. Ziel der hier vorliegenden Arbeit war es die Voraussetzungen für eine präparative enzymatische Synthese dieser wichtigen 6 Desoxyhexose zu schaffen. Aufbauend auf einer vorangegangenen Arbeit zur enzymatischen Synthese von GDP-Mannose, war es das Ziel dieser Arbeit, die bereits vorhandenen rekombinanten Enzymquellen Phosphomannomutase (RfbK/ManB) [EC 5.4.2.8] und GDP-Mannose-Pyrophosphorylase (RfbM/ManC) [EC 2.7.7.13] für die Synthese der GDP-Mannose zu reaktivieren und die Enzyme in größerer Menge zugänglich zu machen. Desweiteren sollte das Enzymsystem durch die Bereitstellung der GDP-D-Mannose-4,6-Dehydratase (GMD) [E.C. 4.2.1.47] sowie des bifunktionellen Enzyms GDP-4-Keto-6-Desoxy-D-Mannose 3,5-epimerase 4-reduktase bzw. GDP-Fucose Synthetase (WcaG/Fcl) [EC nicht klassifiziert] vervollständigt werden. Die Plasmide mit den bereits rekombinant vorliegenden Enzymen Phosphomannomutase und GDP-Mannose-Pyrophosphorylase wurden erneut in Escherichia coli BL21(DE3) transformiert und anschließend im größeren Maßstab überproduziert. Durch Fermentationen im 15 L Maßstab konnten die beiden Enzyme mit einer Gesamtaktivität von 10900 U (69 U/g Zellfeuchtmasse; RfbK/ManB) bzw. 10700 U (75 U/g Zellfeuchtmasse; RfbM/ManC) produziert und danach über eine Anionenaustauschchromatographie an Q-Sepharose FF bis zu einer für die Synthese ausreichenden Reinheit, mit einer Ausbeute von etwa 75 %, partiell aufgereinigt werden. Mittels einer N-terminalen Sequenzanalyse konnte gezeigt werden, dass es sich bei den überproduzierten Proteinen um die Enzyme aus dem rfb-Gencluster (O-Antigen-Biosynthese) von Salmonella enterica LT2 handelt. Desweiteren wurden die Gene gmd und wcaG, die für die noch fehlenden Biosyntheseenzyme GMD und WcaG/Fcl kodieren, einzeln mit Hilfe der PCR aus dem wca-Gencluster („Colanic Acid“) von E. coli K-12 kloniert und anschließend in E. coli BL21(DE3) überproduziert. Durch Fermentation im 20 L Maßstab konnte die rekombinante GMD mit einer Gesamtaktivität von 2800 U (10,1 U/g Zellfeuchtmasse) produziert und partiell mittels Anionenaustauschchromatographie, bis zu einer für die Synthese ausreichenden Reinheit, mit einer Ausbeute von 87 % aufgereinigt werden. Durch eine N-terminale Sequenzanalyse konnte gezeigt werden, dass es sich bei dem klonierten und überproduzierten Protein tatsächlich um das Enzym aus E. coli K-12 handelt. Für die Charakterisierung und Quantifizierung der GMD wurde ein nicht radioaktiver Enzymtest entwickelt und optimiert. Bei der Aktivitätsbestimmung der GMD konnte das Auftreten einer lag-Phase vor Reaktionsbeginn beobachtet werden, ein Phänomen, das bisher für dieses Enzym noch nicht beschrieben worden war. Versuche mit dem partiell aufgereinigten Enzym zeigten, dass das Enzym nach Anionenaustauschchromatographie an Q-Sepharose FF als Apoenzym, also ohne gebundenen Cofaktor, vorliegt. Die weiterhin festgestellte NADP+-Spezifität - Zugabe von NAD+ als Cofaktor führte zu keiner Umsetzung – für die GMD aus E. coli, deckt sich mit den Ergebnissen für das Enzym aus anderen Quellen. Bei diesen Versuchen konnte auch eine Beeinflussung der GMD-Aktivität durch die „exogene“ Zugabe des Cofaktors NADP+ beobachtet werden. Neben der Absolutkonzentration des Cofaktors NADP+ scheint aber auch die reduzierte Form (NADPH) des Pyridinnukleotidcofaktors eine Rolle zu spielen. Für die GMD aus E. coli konnte ein Km-Wert von 206 µM bzw. 280 µM für das natürliche Substrat GDP-Mannose ermittelt werden. Da das Enzym nach der Aufreinigung als Apoenzym vorliegt, konnte auch für den Cofaktor NADP+ (240 µM) und seine reduzierte Form, NADPH, (16 µM) Km-Werte bestimmt werden. Mit der rekombinanten GMD wurde außerdem eine präparative enzymatische Synthese und Isolierung der GDP-4-Keto-6-Desoxy-D-Mannose ausgehend von GDP-Mannose durchgeführt. Dabei konnte die GDP-4-Keto-6-Desoxy-D-Mannose mit einer Gesamtausbeute von etwa 10 % synthetisiert werden. Zur Verifizierung des isolierten Produktes wurde anschließend die Molmasse mittels ESI-MS bestimmt. Die als His-Tag Fusionsprotein überproduzierte GDP-Fucose Synthetase (His-Fcl/His-WcaG) konnte durch Fermentation im 15 L Maßstab mit einer Gesamtaktivität von 13680 U (60 U/g Zellfeuchtmasse) produziert und mittels Immobilisierter Metallionen Affinitätschromatographie (IMAC) nahezu bis Homogenität aufgereinigt werden. Zur Quantifizierung der Fcl-Aktivität konnte neben eines HPLC-Tests auch ein Photometer-Test etabliert werden. Mit der isolierten GDP-4-Keto-6-Desoxy-D-Mannose und der aufgereinigten GDP-Fucose Synthetase gelang in einer batch-Reaktion die Synthese von GDP-Fucose und damit zum einen der Nachweis, dass es sich bei der aufgereinigten WcaG/Fcl tatsächlich um ein bifunktionelles Enzym handelt, und zum anderen, dass für die Synthese von GDP-Fucose ausgehend von GDP-Mannose die Aktivität der beiden rekombinanten Enzyme GDP-D-Mannose-4,6-Dehydratase (GMD) und GDP-Fucose Synthetase (WcaG/Fcl) ausreichend ist. Mit dieser Arbeit konnten die Vorrausetzungen geschaffen werden, die den späteren Einsatz der rekombinanten Enzyme im Rahmen einer präparativen enzymatischen Synthese der GDP-Fucose ausgehend von D-Mannose erlauben.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie
Dokument erstellt am:	06.10.2004
Dateien geändert am:	12.02.2007
Promotionsantrag am:	31.10.2003
Datum der Promotion:	31.10.2003