Dokument: Gentransfer in hämatopoetische Zellen, die Leber und Muskulatur:
HSV-1 Amplikonvektoren zur Erzeugung einer Leukämievakzine
und für die Genersatztherapie

Titel:	Gentransfer in hämatopoetische Zellen, die Leber und Muskulatur: HSV-1 Amplikonvektoren zur Erzeugung einer Leukämievakzine und für die Genersatztherapie
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=2946
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20041001-000946-1
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Müller, Lars [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 709,8 KB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 09.02.2007 / geändert 09.02.2007
Beitragende:	Prof. Dr. Gattermann, Norbert [Gutachter] Prof. Dr. med. Adams, Ortwin [Gutachter] Prof. Dr. Dilloo, Dagmar [Gutachter]
Stichwörter:	HSV-1 Amplikon, Gentherapie, Leukämie, SEAP, Hybridvektor, Hämophilie, Leukämievakzine, Vektorgene therapy, HSV-1 amplicon, leukemia vaccine, hybridvector, hemophilia, SEAP, vector
Dewey Dezimal-Klassifikation:	600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften » 610 Medizin und Gesundheit
Beschreibungen:	Die somatische Gentherapie ist ein vergleichsweise junger Zweig der Medizin, mit dessen Hilfe Krankheitsprozesse durch die Einführung fremder Gene in Körperzellen beeinflusst werden sollen. Der Transfer der fremden DNA in die Wirtszelle erfolgt i.d.R. mit Hilfe viraler oder nicht-viraler Vehikel (Vektoren). Gegenwärtig gibt es Bemühungen, eine große Vielfalt von Erkrankungen auf diese Weise zu behandeln. In der vorliegenden Arbeit wird die genetische Manipulation hämatopoetischer Zellen mit den Ziel der Erzeugung einer Immuntherapie für akute Leukämien (Leukämievakzine) dargestellt. Ein zweites Teilprojekt befasst sich mit dem Gentransfer in die Leber und die Muskulatur und zielt auf die Etablierung eines Modells der Genersatztherapie ab. Beide Teilprojekte verbindet die Verwendung eines Vektorsystems, das sich von Herpes Simplex Virus Typ-1 (HSV-1) ableitet. Die akute lymphatische Leukämie (ALL) ist die häufigste bösartige Erkrankung des Kindesalters. Obwohl in den letzten dreißig Jahren große Fortschritte bei der Behandlung der ALL erzielt worden sind, besteht weiterhin dringender Bedarf für innovative therapeutische Strategien. Das Prinzip der Leukämievakzine besteht darin, die Immunogenität der Leukämiezellen durch den ex vivo Transfer immunstimulatorischer Gene zu verstärken. Murine Modelle belegen, dass die Injektion genetisch modifizierter Leukämiezellen in vivo zu einer systemischen leukämiespezifischen Immunantwort führt, die sich auch gegen unmodifizierte, an anderer Stelle des Körpers befindliche Leukämiezellen richtet. Die Herstellung einer Leukämievakzine für den klinischen Gebrauch wird bisher v.a. durch die Resistenz primärer ALL Blasten gegenüber den meisten etablierten Vektorsystemen behindert. In dieser Arbeit wird die genetische Manipulation humaner und muriner hämatopoetischer Zellen mit Hilfe von HSV-1 Amplikonvektoren untersucht. Dabei zeigt sich, dass unreife CD34+ Zellen, reife mononukleäre Knochenmarkszellen und auch primäre ALL und AML Blasten mit guter Effizienz transduziert werden können. Auf der Grundlage dieser Daten sollte nun die Überprüfung der Sicherheit und Wirksamkeit einer entsprechenden Leukämievakzine im Tiermodell erfolgen. Zahlreiche monogenetische Erkrankungen lassen sich auf die verminderte Aktivität einzelner Proteine zurückführen. Die Bluterkrankheit Hämophilie gilt als ein gutes Beispiel einer monogenetischen Erkrankung, die durch Genersatztherapie positiv beeinflusst werden könnte. Sowohl die Leber als auch die Skelettmuskulatur gelten als mögliche Zielgewebe für die Genersatztherapie. Obwohl sich erfolgreiche Strategien bei der Gentherapie der Hämophilie abzeichnen, besteht weiterhin der Bedarf zur Optimierung der Gentransfertechnik. Insbesondere fehlt bisher Erfahrung mit Vektoren, die eine ausreichende Insertionskapazität aufweisen, um nicht nur die komplementäre DNA (cDNA), sondern auch genomische DNA Sequenzen inklusive aller regulatorischen Elemente aufnehmen können. HSV-1 Amplikonvektoren haben sich in dieser Hinsicht aufgrund ihrer großen Insertionskapazität von theoretisch bis zu 150 kb als vielversprechend erwiesen. Im Hinblick auf die Etablierung eines Modells der Genersatztherapie der Hämophilie wird in der vorliegenden Arbeit der Gentransfer in Hepato- und Myozyten mit Hilfe der HSV-1 Amplikonvektoren untersucht. Zunächst wird die Konstruktion verschiedener Vektorkonstrukte (konventioneller HSV-1 Amplikonvektor, HSV-1/AAV Hybridvektor, HSV-1/EBV Hybridvektor), die ein Reportergen (Sekretierte Alkalische Phosphatase, 1,8 kb) enthalten, beschrieben. Die Funktionsfähigkeit dieser Konstrukte wird in vitro anhand einer Hepatozytenzelllinie demonstriert. In einem zweiten Schritt wird die Effizienz des in vivo Gentransfers in die Leber und Muskulatur gezeigt. In der Zukunft sollte nun geprüft werden, ob auch umfangreiche DNA Sequenzen, wie z.B. die genomische Sequenz des Gerinnungsfaktor IX (~35kb), mit vergleichbarer Effizienz transferiert werden können. Somatic gene therapy is a relatively new field, aimed at treating disease by introducing genes into somatic cells. Gene transfer occurs with the help of viral and non-viral vectors. This thesis work investigates gene therapy approaches for the treatment of two separate disease entities. First, in view of generating immune therapy for acute leukemia, gene transfer into hematopoietic cells, particularly primary acute leukemic blasts, is examined. The second part of the thesis is concerned with two different target organs, the liver and muscle, and aims at establishing a model of hemophilia gene therapy. The connection between both projects is provided by a common vector system, herpes simplex virus type-1 (HSV-1) amplicon vectors. Acute lymphoblastic leukemia (ALL) is the most common malignancy of childhood. Over the last thirty years, great progress with regard to the treatment of ALL has been accomplished. However, the need for innovative therapies remains. The concept of a leukemia vaccine is based on ex vivo gene transfer into leukemic blasts with the goal of augmenting the immunogenicity of the blasts. The subcutaneous injection of genetically modified leukemic blasts in murine models has demonstrated the generation of a potent anti-leukemic immune response, targeting cells at the injection site as well as at remote sites. The generation of a leukemia vaccine for clinical application is currently hampered by the inability of most established vector systems to efficiently transduce primary ALL blasts. This work examines the transduction of human and murine hematopoietic cells using HSV-1 Amplicon vectors. The results indicate that CD34 positive cells, mononuclear cells bone marrow cells, and primary AML and ALL blasts are transduced with great efficiency. Future work will determine the safety and efficacy of HSV-1 amplicon vector transduced leukemic blasts in a murine model. Numerous monogenetic diseases cause the reduced activity of plasma proteins. Hemophilia is a prime example of a condition that may be addressed by gene replacement therapy. Both the liver and skeletal muscle have been identified as target organs for gene therapy. While some successful strategies with regard to gene therapy of hemophilia are becoming apparent, the need for improved gene transfer technology remains. In particular, most established vector systems are capable of transferring complementary DNA (cDNA), but lack the insertion capacity to transfer genomic DNA sequences including all regulatory elements. The large insertion capacity of HSV-1 amplicon of up to 150 kb is very promising in this regard. In view of establishing a model for gene therapy of hemophilia, HSV-1 mediated gene transfer into hepatocytes and myocytes was examined. First, vector constructs (conventional HSV-1 amplicon vs. HSV-1 / AAV hybridvector vs. HSV-1 / EBV Hybrid vector) encoding a secreted reporter protein (secreted alkaline phosphatase, SEAP) were generated. The constructs were tested in vitro, using the NPLC hepatocyte cell line. In addition, in vivo gene transfer was examined by vector injection into the liver and muscle parenchyma of SCID mice. The results indicate highly efficient gene transfer in vitro and in vivo. The duration of gene expression is fivefold increased using the HSV-1 / EBV vector as compared to conventional HSV-1 amplicon vectors. Future studies will determine, if lager constructs, such the human clotting factor IX (~35 kb) can be transferred with equal efficiency.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Medizinische Fakultät
Dokument erstellt am:	01.10.2004
Dateien geändert am:	12.02.2007
Promotionsantrag am:	20.07.2004
Datum der Promotion:	20.07.2004