Dokument: The incorporation of an unnatural amino acid to study the nucleotide binding domain of the ABC transporter HlyB from Escherichia coli

Titel:	The incorporation of an unnatural amino acid to study the nucleotide binding domain of the ABC transporter HlyB from Escherichia coli
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=29453
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20140508-111413-6
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Kirov, Miroslav [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 6,92 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 08.05.2014 / geändert 08.05.2014
Beitragende:	Prof. Dr. Schmitt, Lutz [Betreuer/Doktorvater] PD Dr. Schulte, Ulrich [Gutachter]
Stichwörter:	unnatural amino acid, DMNB-L-serine, protein caging, nucleotide binding domain, ABC transporter, HlyB
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	ABC transporters perform fundamental cellular processes like the import of nutrients or the export of drugs and toxins. They use the same energy source, ATP hydrolysis, to fuel these different processes. The investigation of their ATPase domains can contribute to better understand the principles of substrate translocation of ABC transpoprters. This knowledge might be applied for example in the research and in drug development against cancer cells, which utilize the ABC transporter ABCB1 to export drugs as one mechanism to obtain resistance. Therefore, a detailed understanding of how these proteins perform ATP hydrolysis is of major interest. In this work the nucleotide binding domain (NBD) of the ABC transporter HlyB from E. coli was used as a model system to investigate the mechanism of ATP hydrolysis via protein caging. By means of this strategy the protein was reversibly inactivated (“caged”) by the conjugation to a photolabile protecting group. The aim was to trap the protein in different states of its ATP hydrolysis cycle by incorporation of the photo-caged amino acid DMNB-L-serine and to relieve the trapping by photolysis of DMNB-L-serine to study the ATP hydrolysis cycle in more detail. For this purpose, serines located in the Walker A motif or the D-loop, which are essential for the ATPase activity of HlyB NBD, were replaced with the unnatural amino acid DMNB-L-serine, which can be converted to L-serine by photolysis. Before the incorporation of the unnatural amino acid, the expression of HlyB NBD in S. cerevisiae was established by the screening of different parameters (expression plasmid, temperature or growth medium). Furthermore, different serines mutants were characterized to determine whether the according serine is essential for ATP hydrolysis. Subsequently, the incorporation of DMNB-L-serine into HlyB NBD was established in S. cerevisiae and the resulting mutants were purified successfully. It was not possible to reactivate the Walker A mutant (S504DMNB-L-serine) by photolysis. In contrast, the D-loop mutant (S634DMNB-L-serine) showed ATPase activity as a function of the incubation time, which reached 70 % of the activity of the wild type protein after photolysis. The characterisation of the photolysed protein indicated that the NBD still hydrolysed ATP in a cooperative fashion, however its catalytic properties deviated from the properties of the wild type protein. Based on the involvement of the D-loop in the ATP-ADP transition of the nucleotide bound HlyB NBD, the regained activity of the D-loop mutant indicated that this region is dynamic and flexible. Based on its role in the inter-monomer communication, the manipulation of the D-loop probably disrupts the allosteric communication between the monomers in the HlyB NBD dimer. ABC Transporter sind für essentielle zelluläre Prozesse wie z. B. den Import von Nährstoffen, die Resistenz gegen unterschiedliche Xenobiotika oder die Sekretion von Toxinen verantwortlich. Die Energie für den aktiven Transport ihrer Substrate gewinnen sie durch die Hydrolyse von ATP. Durch die Untersuchung der ATPase Domäne kann ein besseres Verständnis der Prinzipien des aktiven Transports dieser Membranproteine erlangt werden. Dieses könnte z. B. in der Forschung oder in der Entwicklung von Wirkstoffen gegen Krebszellen eingesetzt werden, die den ABC-Transporter ABCB1 zum Export von Xenobiotika verwenden. Aus diesem Grund würde eine detaillierte Aufklärung des Mechanismus der ATP-Hydrolyse weitere wichtige Erkenntnisse dafür liefern. In dieser Arbeit wurde die Nukleotid-bindende Domäne (NBD) des ABC Transporters Haemolysin B (HlyB) aus E. coli als Modellsystem verwendet, um den Mechanismus der ATP-Hydrolyse mittels Protein-„Caging“ zu untersuchen. Mit dieser Strategie wurde das Protein inaktiviert, indem eine photolabile Schutzgruppe eingebaut wurde. Für die ATP-Hydrolyse essentielle Serine des Walker A Motivs oder des D-Loops wurden gegen die nicht natürliche, photolabile Aminosäure DMNB-L-Serin mutiert. Diese kann mittels Lichtbestrahlung zu L-Serin photolysiert werden. Diese Strategie sollte es ermöglichen, die HlyB NBD in bestimmten Zuständen ihres katalytischen Zyklus zu arretieren und anschließend nach Photolyse zu reaktivieren. Vor dem Einbau von DMNB-L-Serin wurde die HlyB NBD Expression in S. cerevisiae etabliert, indem unterschiedliche Parameter (Expressionsplasmid, Temperatur oder Nährmedium) analysiert wurden. Darüber hinaus wurden unterschiedliche Serin-Mutanten charakterisiert, um zu überprüfen, ob die entsprechenden Serine essentiell für die ATPase Aktivität des Proteins sind. Im Anschluss wurde der DMNB-L-Serin-Einbau in S. cerevisiae etabliert und die entsprechenden HlyB NBD Mutanten aufgereinigt. Eine Walker A Mutante (S504DMNB-L-Serin) zeigte keine Aktivität, jedoch führte Lichtbestrahlung zu keiner Reaktivierung. Im Gegensatz dazu zeigte eine D-Loop Mutante (S634DMNB-L-Serin) nach erfolgreicher Photolyse eine zeitabhängige ATPase Aktivität, die 70 % der Aktivität des Wildtypproteins erreichte. Obwohl diese photolysierte Mutante Kooperativität bei der ATP Hydrolyse zeigte, wichen ihre katalytische Eigenschaften von denen der Wildtyp HlyB NBD ab. Aufgrund der beobachteten Mitwirkung des D-Loops als „Scharnier“ bei dem Übergang von ATP- zur ADP-gebundenen HlyB NBD, deuteten die Ergebnisse darauf hin, dass der D-Loop dynamisch und flexibel ist. Die Beteiligung des D-Loops an der Monomer-Monomer Wechselwirkungen innerhalb des HlyB NBD Dimers ließ vermuten, dass die Mutation von Serin 634 aus dem D-loop die allosterische Kommunikation zwischen den Monomeren unterbrach.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Chemie » Biochemie
Dokument erstellt am:	08.05.2014
Dateien geändert am:	08.05.2014
Promotionsantrag am:	01.04.2014
Datum der Promotion:	28.04.2014