Dokument: Biochemical and structural characterization of Rho family proteins and their interaction with Plexin-B1 and IQGAP1

Titel:	Biochemical and structural characterization of Rho family proteins and their interaction with Plexin-B1 and IQGAP1
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=29442
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20140519-105221-6
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Dr. Kalawy Fansa, Eyad [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 4,14 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 08.05.2014 / geändert 08.05.2014
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	The Rho family proteins were initially characterized as regulators of the cytoskeleton, thereby controlling a diversity of cellular function such as morphogenesis, phagocytosis, pinocytosis, cytokinesis, axonal growth, cell-cell adhesion, cell-substrate adhesion, cell polarity, cell cycle and cell locomotion. Rho proteins function as molecular switches cycling between active (GTP-bound) and inactive (GDP-bound) states. The intrinsic functions of Rho proteins, i.e. GDP/GTP exchange and GTP-hydrolysis are rather slow and require tight regulation. Guanine nucleotide exchange factors (GEFs) catalyze the intrinsic nucleotide exchange, whereas GTPase activating proteins (GAPs) stimulate the intrinsic GTP hydrolysis. Intrinsic functions have been partially investigated in the case of RhoA, Rac1 and Cdc42, but for others not at all. Due to the variety of important cellular processes in which the Rho proteins are involved, the identification and characterization of the target effector has been intensively investigated in order to understand the transmission of signals between Rho proteins and their interacting partners. The interaction of Rho proteins with Plexin-B1, one of the members of the transmembrane Plexin receptors, has been shown to be involved in axonal growth. The scaffolding protein IQGAP1 has been shown to interact with members of the Rho family regulating cell-cell adhesion. In this thesis a comprehensive analysis of the intrinsic properties of Rho proteins as well as a structure-function analysis of their interaction with Plexin-B1 and IQGAP1 has been described. The analysis of the intrinsic functions of Rho proteins revealed firm evidence for critical differences in the biochemical properties not only among the highly related Rho and Rac isoforms but also among all members of Rho family beyond RhoA, Rac1 and Cdc42. It was believed that the intrinsic GTP hydrolysis of Rho proteins is faster than intrinsic GDP/GTP nucleotide exchange. Thus, Rho proteins were understood to persist in the GDP-bound (inactive) form or alternatively in complex with GDIs in resting cells. The circumstances for RhoD and Rif were different. The nucleotide dissociation from these two proteins was relatively fast, exceeding dissociation rate values of other Rho proteins by almost three orders of magnitude, supporting a shifted the paradigm of classical regulation of small GTP binding proteins. Valuable findings about the interaction between Plexin-B1 and Rho proteins have been achieved. Thus, B1RBD revealed interaction with the active forms of all Rnd and Rac isoforms as well as with RhoD, but not with other members of the Rho family, including RhoA, Cdc42, RhoG and Rif. Moreover, Rnd1 was shown to displace Rac1 from its complex with B1RBD. Illumination of the selectivity of Plexin-B1 towards Rho proteins revealed a negative charged loop region, called B1L31, which facilitates to some extent the B1RBD / Rho proteins interaction and thereby might influence the selectivity for distinct Rho protein. Novel findings regarding the molecular details of IQGAP1 / Rho proteins interactions have been revealed. Thus, IQGAP1 showed a selective interaction with Rac1- and Cdc42-like proteins, e.g Rac1, Rac2, Rac3, RhoG, Cdc42 and TC10, but not with other members of the Rho family such as RhoA, RhoB, RhoC, Rnd1, Rnd2, Rnd3, RhoD and Rif. In addition, Rac1 and Cdc42 showed an overlapping binding sit on the surface of IQGAP1. Detailed kinetic measurements revealed that Cdc42 and Rac2 have the highest affinity to IQGAP1 in the low nanomolar range, while Rac1, Rac3 and RhoG displayed an intermediate affinity in the sub micromolar range, and TC10 with the lowest affinity in the micromolar range. Moreover, we showed that the C-terminal half of IQGAP1 binds with higher affinity to Rac1 and Cdc42 as compared to another fragment comprising only the GAP related domain (GRD) of IQGAP1. Lastly we discovered two negative charged areas on the surface of Rho- and Rnd-like proteins, which might explain their inaccessibility and thus their lack of interaction with IQGAP1. The comprehensive study of the intrinsic biochemical properties of Rho proteins is a good starting point for more detailed biochemical analysis of Rho family proteins in the interplay with three GDIs, 75 GEFs and 85 GAPs, and their interaction with and activation of more than 100 effector proteins. In addition, the structure function analysis of Rho proteins interactions with Plexin-B1 and IQGAP1 increased the understanding of the molecular details and added new insights into these interactions. These new insights are needed together with the cellular information to discover new tools for studying the cellular functions mediated by Plexins and IQGAPs and to design new therapeutic agents against their related diseases. Proteine der Rho-Familie wurden ursprünglich als Regulatoren der Zytoskelettdynamik beschrieben. Dadurch kontrollieren sie eine Vielfalt zellulärer Funktionen, wie z.B. Morphogenese, Phagozytose, Axonwachstum, Zell-Zell-Adhäsion, Zell-Polarität, und Zell-Migration. Rho-Proteine wirken als molekulare Schalter, die zwischen einem aktiven (GTP-gebundenen) und inaktiven (GDP-gebundenen) Zustand wechseln. Die intrinsischen Funktionen der Rho-Proteine, welche GTP-Hydrolyse und Nukleotid-Austausch umfassen, verlaufen eher langsam und erfordern eine strenge Regulierung. Guanin Nukleotid-Austauschfaktoren (Guanin nucletide exchange faktors, GEFs) katalysieren den intrinsischen Nukleotidaustausch, während GTPase-aktivierende Proteine (GTPase activating proteins, GAPs) die intrinsische GTP-Hydrolyse stimulieren. Diese intrinsischen Funktionen waren zu Beginn dieser Arbeit im Falle von RhoA, Rac1 und Cdc42 eingehend beschrieben, nicht hingegen für weitere Mitglieder der Rho- Famailie. Durch die Wechselwirkung mit Interaktionpartnern sind Rho-Proteine an einer Vielzahl wichtiger zellulärer Prozesse beteiligt. Die Wechselwirkung von Rho-Proteinen mit Plexin-B1, einem Mitglied der Plexin-Familie von Transmembranrezeptoren, ist in der Regulation des Axon-Wachstums beteiligt. Das multidomain-Protein IQGAP1 interagiert mit Mitgliedern der Rho-Familie und ist dabei an der Regulation der Zell-Zell- Adhäsion beteiligt. Im Gegenteil zu klassichen Effektoren von Rho-Proteinen, wie z.B. der Rho-assoziierten-Proteinkinase (Rho-associated protein kinase, ROCK), deren Interaktion mit Rho-Proteinen intensiv untersucht und charakterisiert worden ist, waren zu Beginn der Arbeit molekulare einige Details der Interaktionsmechanismen von Rho- Proteinen mit Plexin-B1 und IQGAP1 unbekannt. In dieser Arbeit wurden eine umfassende Analyse der intrinsischen Eigenschaften von Rho-Proteinen sowie eine Struktur-Funktion-Analyse ihrer Interaktionen mit Plexin- B1 und IQGAP1 durchgeführt. Die Analyse der intrinsischen Funktionen von Rho- Proteinen ergab kritische Unterschiede in deren biochemischen Eigenschaften nicht nur innerhalb der sehr verwandten Rho- und Rac-Isoformen, sondern auch zwischen allen Mitgliedern der Rho-Familie. Es war angenommen, dass die intrinsische GTP-Hydrolyse von Rho-Proteinen schneller verläuft als der intrinsische GDP / GTP Nukleotid- Austausch. Des Weiteren wurde vermutet, dass Rho-Proteine in ruhenden Zellen in der GDP-gebundenen (inaktiven) Form oder alternativ im Komplex mit Guanin-Nukleotid- Dissoziation Inhibitoren (Guanine nucleotide dissociation inhibitors, GDIs) vorliegen. Dagegen, zeigten jedoch RhoD und Rif eine um fast drei Größenordnungen schnellere Nukleotid-Dissoziation als alle bisher untersuchten Rho-Proteine. Diese Befunde unterstützen eine Verschiebung des Paradigmas der klassischen intrinsischen biochemischen Eigenschaften von kleinen GTP-bindende Proteinen. Im Rahmen dieser Arbeit konnten ebenfalls die Interaktion von Plexin-B1 mit Rho-Proteinen näher charakterisiert werden. Eine Interaktion der Rho-bindenden-Domäne von Plexin-B1 (B1RBD) mit den aktiven Formen aller Rnd- und Rac-Isoformen sowie mit RhoD, nicht aber mit den anderen Mitgliedern der Rho-Familie, konnte in vitro demonstriert werden. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass Rnd1 in einer kompetitiven Art und Weise Rac1 aus seinem Komplex mit B1RBD verdrängen kann. Eine detaillierte Untersuchung der Interaktionsselektivität von Plexin-B1 mit Rho- Proteinen konnte eine negativ-geladene loop-Region, genannt B1L31, definieren, die die B1RBD-Rho-Proteininteraktion erleichtert und dadurch möglicherweise die Selektivität für ein bestimmtes Rho-Protein determiniert. Des Weiteren konnten in Rahmen dieser Arbeit neuartige Erkenntnisse über die molekularen Details der Wechselwirkung von IQGAP1 mit Rho-Proteinen gewonnen werden. IQGAP1 zeigte in vitro eine selektive Interaktion mit Rac1- und Cdc42- ähnlichen Proteinen, nicht jedoch mit den anderen Mitgliedern der Rho-Familie. Detaillierte kinetische Analysen ergaben, dass Cdc42 und Rac2 die höchste Affinität zu IQGAP1 im niedrig-nanomolaren Bereich aufweisen, während Rac1, Rac3 und RhoG durch eine mittlere Affinität im submikromolaren Bereich und TC10 durch die niedrigste Affinität im mikromolaren Bereich gekennzeichnet sind. Schließlich wurden zwei negativ-geladene Bereiche auf der Oberfläche Rho- und Rnd-ähnlicher Proteine definiert, durch deren elektrostatische Wirkung möglicherweise die fehlende Interaktion mit IQGAP1 erklärt werden könnte. Die Charakterisierung intrinsischer biochemischer Eigenschaften von Rho- Proteinen stellt einen zentralen Ausgangspunkt für das biochemische Verständnis der Interaktionen von Rho-Proteinen mit ihren Regulatoren und Effektoren dar. Die hier bei der Struktur-Funktion-Analyse der Interaktion von Rho-Proteinen mit Plexin-B1 und IQGAP1 gewonnenen Befunde tragen wesentlich zum molekularen Verständnis dieser Interaktionen bei. Diese neuen in vitro Erkenntnisse stellen eine Grundlage für eine weiterführende Untersuchung der zellulären Funktionen von Plexinen und IQGAPs dar, mit dem langfristigen Ziel, therapeutische Ansatzpunkte für assoziierte Erkrankungen zu definieren und zu testen.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie
Dokument erstellt am:	19.05.2014
Dateien geändert am:	19.05.2014
Promotionsantrag am:	02.09.2010
Datum der Promotion:	19.07.2013