Dokument: Funktionelle Charakterisierung der drei DAHP-Synthase Isoformen aus Arabidopsis thaliana

Titel:	Funktionelle Charakterisierung der drei DAHP-Synthase Isoformen aus Arabidopsis thaliana
Weiterer Titel:	Functional characterization of the three DAHP-synthase isoforms in arabidopsis thaliana
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=29408
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20141203-095601-2
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Pietzke-Calcagnile, Anja [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 1,84 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 02.05.2014 / geändert 02.05.2014
Beitragende:	Prof. Dr. Janzik, Ingar [Gutachter] Prof. Dr. Jaeger, Karl-Erich [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	In Arabidopsis wurden aufgrund von Sequenzhomologien drei Gene identifiziert, die putativ für Isoformen des Eingangsenzyms des Shikimatwegs, die 3-Deoxy-D-arabino-heptulosonat 7-phosphat-Synthase (DAHPS) kodieren. In einer Reihe von Arbeiten konnte bereits gezeigt werden, dass diese Gene transkribiert und sehr unterschiedlich reguliert werden. In dieser Arbeit wurde nun erstmals durch heterologe Expression nachgewiesen, dass alle drei für funktionelle DAHPS kodieren. Die Expressionsdaten weisen darauf hin, dass die drei DAHPS unterschiedliche Funktionen erfüllen. So werden die DAHP-Synthasen 1 und 3 durch Stressfaktoren wie Pathogenbefall, UV-Licht, Ozon oder Verwundung in ihrer Expression induziert, die Expression der DAHP-Synthase 2 hingegen bleibt meist fast unverändert. Ob diese Regulation der drei Gene jedoch nur zu unterschiedlichen Mengen an DAHPS-Enzym führt, oder ob sich die drei Enzyme auch biochemisch unterscheiden, war bisher unbekannt. Bei der Analyse der biochemischen Eigenschaften der heterolog in E. coli exprimierten Enzyme weisen die drei Isoenzyme sehr viele Ähnlichkeiten auf. Alle drei Isoformen werden durch reduziertes Thioredoxin aktiviert, so dass ihre Aktivität vermutlich auch in vivo einer Redoxregulation unterliegt. Sie werden alle deutlich durch Manganionen aktiviert und durch höhere Konzentrationen von Magnesiumionen in schwächerem Maße. Alle drei Enzyme finden in einem Temperaturbereich zwischen 40 und 45°C sowie bei pH 7,0 optimale Bedingungen und sie verwenden alle ausschließlich E4P neben PEP als Substrat. Trotz dieser Gemeinsamkeiten deuten die Ergebnisse dieser Arbeit darauf hin, dass der DAHP-Synthase 3 eine zentrale Rolle unter den drei Isoformen zukommt. Ihr pH-Optimum ist breiter als das der anderen beiden Isoformen und sie zeigt auch noch bei pH 6,0 optimale Aktivität während die anderen beiden Enzyme bei diesem pH-Wert in ihrer Aktivität schon stark abfallen. Die maximale Reaktionsgeschwindigkeit der DHS3 liegt signifikant höher als die der DAHP-Synthasen 1 und 2. Während die Isoformen 1 und 2 in ihrer Aktivität durch Phenylalanin oder Tryptophan aktiviert werden, zeigt sich die Isoform 3 unbeeinflusst durch die aromatischen Aminosäuren. Darüber hinaus zeigen die Expressionsstudien in Blatt- und Wurzelmaterial, dass die DAHP-Synthase 3 in beiden Geweben deutlich stärker exprimiert ist als die anderen beiden Isoenzyme. Diese Ergebnisse unterstreichen die Befunde der Transkriptionsanalysen, in denen sich dieses Enzym als stressinduziert erwies. Als Reaktion auf Stress werden diverse Sekundärmetabolite synthetisiert für die unter Stresseinwirkung innerhalb kurzer Zeit große Mengen an Chorismat bereitgestellt werden müssen. Diese Aufgabe kann die DAHP-Synthase 3 mit ihrer hohen maximalen Aktivität und ihrer erhöhten Unabhängigkeit gegenüber den umgebenden pH-Bedingungen, sowie ihrer hohen Expression in Wurzel und Spross gut erfüllen. Eine Co-Expressionsanalyse zeigt ebenfalls die starke Verknüpfung der Expression dieser Isoform mit Enzymen des Phenylpropanoidweges, in dem eine Vielzahl von Sekundärmetaboliten synthetisiert wird. Die Co-Expressionsanalyse für die DAHP-Synthase 1 weist eher auf eine Verbindung zur Tryptophan- und Auxin-Biosynthese hin, so dass diese Isoform möglicherweise über den Tryptophan- und Auxinbedarf reguliert wird. Eine vergleichende Analyse von Wildtyp-Pflanzen (Col-0) und Knockout-Mutanten zur weiterführenden Klärung der unterschiedlichen Funktionen für die verschiedenen DAHP-Synthasen ergab bei der Anzucht unter Standardbedingungen phänotypisch keine Unterschiede. Nur die Knockout-Mutante für die DAHP-Synthase 2 weist auf Metabolitenebene einen signifikant deutlich erhöhten Gehalt an Phenylalanin und einen leicht erhöhten Gehalt an Tryptophan im Vergleich zum Wildtyp und den anderen Knockout-Mutanten auf. Unter veränderten Anzuchtbedingungen werden jedoch phänotypische Unterschiede zwischen dem Wildtyp und einigen Knockout-Pflanzen sichtbar. Sowohl bei einem Wechsel der Tag/Nacht-Rhythmik zu einer Dauerbelichtung sowie beim Transfer in eine kalte Umgebungstemperatur von 10°C wiesen Knockout- und Wildtyp-Pflanzen deutliche Unterschiede auf. Unter Dauerbelichtung zeigen die Wildtyp-Pflanzen im Gegensatz zu den Mutanten eine signifikant höhere Zunahme des Frischgewichts. Bei Kälte zeigt die Doppelmutante die höchste Zunahme an Frischgewicht im Vergleich zu den Wildtyp- und anderen Knockout-Pflanzen. Die in dieser Arbeit ermittelten Parameter, wie Ammonium- und Phenolgehalte sowie Aminosäurekonzentrationen erklären die deutlich veränderten Wachstumsreaktionen auf die veränderten Umweltbedingungen nicht und verweisen auf eine komplexere Funktion der DAHPS Isoformen als bisher angenommen. Based on sequence homology one identified in Arabidopsis three genes that code for putative isoforms of the entry enzyme of the shikimate pathway 3-Deoxy-D-arabino-heptulosonate 7-phosphate synthase (DAHPS). In several investigations one already showed that these enzymes are transcripted and very differently regulated. In this work it is demonstrated for the first time that all three genes actually code for functional DAHPS. The expression data indicate that the three DAHPS fulfil different functions. While the expression of DAHP-synthases 1 and 3 is induced by stress factors like pathogens, UV-light, ozon and wounding, the expression of DAHP-synthase 2 is nearly unaffected. If this regulation of the three genes only leads to a different amount of enzyme or if there are also differences in their biochemical characteristics was so far unknown. The analysis of the biochemical characteristics of the three enzymes, that were heterologously expressed in E. coli, reveals a lot of similarities. All three isoforms are activated by reduced thioredoxin, what suggests a redox regulation of their activity also in vivo. They are all clearly activated by manganese ions and weaker activated by higher concentrations of magnesium ions. The three enzymes find optimal conditions in a temperature range of 40- 45°C as well as in a pH of 7,0 and they bind specifically to the substrates E4P and PEP. But in spite of these similarities, the results of this work indicate that DAHP-synthase 3 may play a central role under these three isoenzymes. The pH-optimum of DAHP-synthase 3 is broader than that of the other two enzymes. It still shows optimal activity in a pH of 6,0, while the activity of the other two enzymes already clearly decreases under these conditions. The maximum rate of reaction of DAHP-synthase 3 is significantly higher than the maximum rates of DAHP-synthases 1 and 2. While the isoforms 1 and 2 are influenced by the addition of phenylalanine or tryptophan to the reaction buffer, the activity of DAHP-synthase 3 is unaffected by the aromatic amino acids. In addition the analysis of gene expression in roots and shoots reveals that DAHP-synthase 3 clearly shows the highest expression of the three enzymes in both tissues. These results underline the findings of transcription studies, which showed the stress inducibility of this isoform. As a reaction to different stress factors diverse secondary metabolites are synthesized for which chorismate has to be provided in great quantities within a short time. The enyzme DAHP-synthase 3 is able to fulfil this function with its high maximum rate of reaction and its elevated independence of the pH-conditions and its strong expression in root and shoot. A co-expression analysis also shows a strong link of the expression of this isoform to the expression of several enzymes of the phenylpropanoid pathway, in which a lot of secondary metabolites are synthesized. The co-expression analysis for DAHP-synthase 1 shows a link to the biosynthesis of tryptophan and auxin, so that this isoform is possibly regulated by the demand for tryptophan or auxin. A comparative analysis of wildtype plants (Col-0) and knockout mutants for a further investigation of the different functions of the three DAHPS exhibited no phenotypic differences under standard growth conditions. Only the knockout mutant for DAHP-synthase 2 shows on metabolic level significantly higher concentrations of phenylalanine and slighly elevated concentrations of tryptophan in comparison to the other plants. Altered growth conditions uncover some differences between the wildtype plants and some knockout mutants. The change of day/night rhythm to continuous light as well as the transfer into a cold environment of 10°C reveals clear differences between the wildtype and knockout plants. In continuous light the wildtyp plants have a higher fresh weight than the knockout mutants. Under cold conditions the double mutant for DAHP-synthases 2 and 3 shows a higher increase of fresh weight than the other plants. The parameters like the amount of ammonium and phenols or the concentration of amino acids, determined in this work, do not explain this clearly changed growth behaviour in answer to the modified environmental conditions. This indicates a more complex function of the DAHPS as previously assumed.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie
Dokument erstellt am:	03.12.2014
Dateien geändert am:	03.12.2014
Promotionsantrag am:	21.05.2013
Datum der Promotion:	09.01.2014