Dokument: Komparative Analyse der adaptiven thermischen Eigenschaften lipolytischer Enzyme mit differentem Temperatur-Ursprung
| Titel: | Komparative Analyse der adaptiven thermischen Eigenschaften lipolytischer Enzyme mit differentem Temperatur-Ursprung | |||||||
| Weiterer Titel: | Comparative analysis of the adaptive thermal properties of lipolytic enzymes with differentem temperature origin | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=29332 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20140428-140349-0 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Dipl. Biologin Mandrysch, Agathe [Autor] | |||||||
| Dateien: |
| |||||||
| Beitragende: | Prof. Dr. Jaeger, Karl-Erich [Gutachter] PD Dr. Pohl, Martina [Gutachter] | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie | |||||||
| Beschreibungen: | Psychrophile und thermophile Mikroorganismen produzieren als natürliches Ergebnis der Adaption an ihre Umgebungstemperatur spezifische Biokatalysatoren. Diese funktionieren unter extremen Temperaturen, bei denen ihre mesophilen Gegenstücke nicht bestehen könnten. Ihre außergewöhnlichen thermischen Eigenschaften machen diese Enzyme zu interessanten Objekten für den industriellen und biotechnologischen Einsatz. Daher besteht großes Interesse an der Erforschung der molekularen adaptiven Mechanismen, die sie befähigen, bei extremen Temperaturen ihre Stabilität und katalytische Aktivität aufrecht zu erhalten.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde zur Analyse dieser Fragestellung ein vergleichender bioinformatischer Ansatz mit experimenteller Verifizierung verfolgt. Der Vergleich mehrerer strukturell ähnlicher Enzyme verschiedenen Temperatur-Ursprungs, sollte die jeweilige Temperatur-Adaption der Enzyme aufdecken. Dazu wurde ein homologes Set an lipolytischen Enzymen generiert, welches aus einem Template-Enzym mit bekannter Struktur und homologen Enzymen unterschiedlichen Temperatur-Ursprungs besteht. Als Template wurde die bereits charakterisierte thermophile Esterase Est2 aus Alicyclobacillus acidocaldarius festgelegt und deren Homologe, LipS aus dem psychrophilen Stamm Shewanella halifaxensis, LipB aus dem mesophilen Stamm Burkholderia thailandensis und LipP aus dem psychrotoleranten Stamm Pseudomonas sp. B11 -1, gewählt. Die komparative Analyse der Strukturen auf Basis der Kristallstruktur von Est2 und generierten Modellen der homologen Enzyme zeigte die starke Konservierung des alpha/beta-Hydrolase-Faltungsmotivs und des aktiven Zentrums. Die homologen Enzyme konnten mittels heterologer Expression und anschließender Reinigung für eine biochemische Charakterisierung zur Verfügung gestellt werden. Diese bestätigte, dass trotz ihrer Struktur- und Sequenzähnlichkeit die thermischen Eigenschaften an ihren Temperatur-Ursprung angepasst sind. Die höchste Aktivität zeigten LipS, LipP und LipB bei 30 °C, 35 °C bzw. 40 °C. Die Untersuchung der Stabilität der Enzyme verdeutlichte den thermolabilen Charakter von LipS und LipP. Damit konnten LipB und LipS erstmals charakterisiert werden. Vergleichende Analysen der Sequenz, Struktur und molekulardynamischer Simulationen konnten spezifische Unterschiede in den Oberflächenloops 2 und 12 der vier Enzyme identifizieren. Die Bedeutung dieser Strukturen für die Temperatur-Adaption wurde durch den gezielten Austausch der Loops zwischen den Enzymen nachgewiesen. Die Insertion von mesophilen und psychrophilen Loops in das thermophile Enzym Est2 bewirkte eine Schwächung der Stabilität von Est2 bei Temperaturen > 50 °C, während die Stabilität < 50 °C deutlich erhöht wurde. Verschiedene Aspekte wie die Länge und Zusammensetzung der Loops werden als molekulare Gründe für deren Bedeutung für die Temperatur-Adaption diskutiert. Die hier verfolgte Strategie, bestehend in der spezifischen Auswahl homologer Enzyme und komparativer Untersuchungen, ist nach heutigem Stand die erste vergleichende Analyse einer Serie von vier alpha/beta Hydrolasen, speziell Esterasen, aus dem gesamten Temperaturspektrum.Psychrophilic and thermophilic microorganisms produce specific biocatalysts, so-called extremozymes, as a natural result of their adaptation to the environmental temperature. They function under extreme temperatures which their mesophilic counterparts cannot stand. Due to their specific thermal properties these biocatalysts have attracted attention for diverse industrial and biotechnological applications. Therefore, there is great interest in understanding molecular adaptive mechanisms that enable them to maintain their stability and catalytic activity at extreme temperatures. In this work, a comparative bioinformatic and computational approach combined with experimental verification has been applied to address this question. The comparison of several structurally related enzymes originating from organisms with different growth temperature optima should reveal details about their temperature adaptation. A set of four lipolytic enzymes consisting of a template enzyme of known structure, and homologous enzymes with different temperature origin has been defined. As the template enzyme the well studied thermophilic esterase Est2 from the Alicyclobacillus acidocaldarius was chosen. As homologous enzymes LipS from psychrophilic Shewanella halifaxensis, LipB from mesophilic Burkholderia thailandensis and LipP from psychrotolerant Pseudomonas sp. strain B11-1 were selected. The extensive structural comparisons of Est2 X-ray structure and homology models of the three other homologous enzymes led to the conclusion that the overall structures including conserved alpha/beta-hydrolase-fold and the active sites are similar. To investigate the biochemical properties of these enzymes, recombinant LipS, LipP and LipB were expressed heterologously as soluble and catalytically active enzymes. The enzymes were purified to homogeneity by immobilised metal affinity chromatography. Thus LipB and LipS could be characterized as novel bacterial esterases. LipS, LipP and LipB showed temperature optima at 30 °C, 35 °C and 40 °C respectively. The investigation of the stability demonstrated the thermolabile character of psycrophilic LipS and psychrotolerant LipP. Therefore we conclude that, despite their structural and sequence similarity, thermal properties of the four studied esterases resemble the growth temperature of their source organisms. Comparative analysis of the sequence, structure, and molecular dynamics simulations revealed notable differences in surface loops 2 and 12 in all four enzymes. The importance of these loops for temperature adaptation was demonstrated by the exchanging them between here analysed enzymes. The insertion of mesophilic and psychrophilic loops in the thermophilic enzyme Est2 caused a weakening of the stability of Est2 at temperatures > 50° C, while the stability of < 50 ° C was significantly increased. Various aspects such as the length and amino acid composition of the loops are discussed as possible reasons for observed changes in thermal properties of these Est2 loop-variants. Here presented strategy accompanying selection of enzymes with conserved sequence and structure, but different temperature origin, bioinformatic and computational analyisis as well as experimental-biochemical comparative analysis is to our knowledge for the first applied for study thermal properties of enzymes belonging to the large family of alpha/beta-hydrolases. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Enzymtechnologie | |||||||
| Dokument erstellt am: | 28.04.2014 | |||||||
| Dateien geändert am: | 28.04.2014 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 05.08.2013 | |||||||
| Datum der Promotion: | 16.10.2013 |
