Dokument: Nachweis von Adenovirus DNA mittels einer quantitativen Polymerase Ketten Reaktion

Titel:	Nachweis von Adenovirus DNA mittels einer quantitativen Polymerase Ketten Reaktion
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=2928
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20040829-000928-2
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Clauberg, Ralf [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 847,4 KB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 09.02.2007 / geändert 09.02.2007
Beitragende:	Prof. Dr. med. Adams, Ortwin [Gutachter] Prof. Dr. Schroten, Horst [Gutachter]
Stichwörter:	Adenovirus, Real-time PCR, PBMC, Quantitative PCR, Myokarditis, TaqMan, DNA-Extraktion, beta-Actin, TCID-50
Dewey Dezimal-Klassifikation:	600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften » 610 Medizin und Gesundheit
Beschreibung:	Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein Verfahren zum quantitativen Nachweis von Adenovirus DNA mittels TaqMan-PCR etabliert und im Anschluss anhand von klinischen Proben verschiedener Herkunft getestet. Als initialer Schritt einer diagnostischen PCR kann die DNA-Extraktion aus dem Ausgangsmaterial angesehen werden. Es wurden verschiedene Methoden zur DNA-Extraktion mit besonderem Fokus auf der Extraktion aus Vollblut in Hinblick auf Empfindlichkeit (DNA-Konzentration im Extrakt) und Effizienz (DNA-Menge/Blutvolumen) mittels des house-keeping Gens beta-Actin in einer TaqMan-PCR untersucht. Die früher im Institut eingesetzte Methode, die Aufreinigung der zellulären Bestandteile im Dextran Gradient mit anschließendem Proteinase K Verdau, erwies sich dabei als verbesserungsfähig durch kommerziell angebotene Extraktionsverfahren. Bei den in diesem Zusammenhang verwendeten Reagenzien-Sets konnte das AquaPure Kit in beiderlei Hinsicht die besten Ergebnisse erzielen. Mit einer wesentlichen Modifikation, dem Einsatz eines Dextran-Carriers, ließ sich mit ihm die Methodik auf die in einer Universitätsklinik häufig anzutreffenden leukopenischen Blutproben erfolgreich adaptieren. Als geeignete Zielsequenz der TaqMan-PCR wurde mit Hilfe von Sequenzalignments ein Bereich der Hexonregion des Adenovirusgenoms herausgearbeitet. Dieser stellte sich auch zwischen den verschiedenen Adenovirustypen als relativ gut konserviert dar. Die in diesem Bereich des Genoms dennoch vorhandenen Sequenzdifferenzen zwischen den Adenovirustypen zeigten sich allerdings mit einer ersten, anhand der Sequenz von Adenovirus Typ 7 optimierten Sonde als zu gravierend, um einen typenübergreifenden Adenovirusnachweis zu gewährleisten. Bei einer späteren optimierten Sonde wurden daher an bestimmten, durch ein Alignment der Zielsequenz identifizierten Positionen zwei oder mehr verschiedene Basen in ungefähr äquimolaren Mengen in die Sonde eingebaut (�Wobbling�). Dadurch konnte ein typenübergreifender Adenovirus DNA Nachweis gewährleistet werden. Mit dieser PCR wurden 274 DNA-Extrakte aus PBL untersucht. Ein sicherer Nachweis von Adenovirus DNA gelang in 3 Fällen. Außerdem wurden 64 DNA-Extrakte aus Myokardbiopsien von Myokarditis Patienten untersucht, dabei gelang ein sicherer Nachweis in 5 Fällen. Zusätzlich wurden die quantitativen Ergebnisse eines klassischen virologischen Tests, des TCID-50, mit dem der etablierten PCR verglichen. Dabei zeigten sich deutliche typenbezogene Unterschiede zwischen der durch den TCID-50 bestimmten infektiösen Dosis 50% und dem jeweiligen typenbezogenen DNA-Kopien Korrelat, was auf das bekannte Vorhandensein von defekten Viruspartikeln zurückzuführen sein könnte. Insgesamt erwies sich die quantitative Real Time PCR als gut reproduzierbare, hoch sensitive Methode zum Virusgenomnachweis. Im Vergleich zur konventionellen PCR stehen leicht erhöhte Materialkosten einem deutlich reduzierten Arbeitsaufwand gegenüber, so dass auch aus wirtschaftlichen Erwägungen dieser Methode ein fester Stellenwert in der molekularen Diagnostik zukommen wird.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Medizinische Fakultät
Dokument erstellt am:	29.08.2004
Dateien geändert am:	12.02.2007
Promotionsantrag am:	25.06.2004
Datum der Promotion:	25.06.2004