Dokument: Die molekulare Funktionsweise des uropathogenen RTX Toxins Haemolysin A aus Escherichia coli
| Titel: | Die molekulare Funktionsweise des uropathogenen RTX Toxins Haemolysin A aus Escherichia coli | |||||||
| Weiterer Titel: | The Molecular Functionality of the Uropathogenic RTX Toxin Haemolysin A from Escherichia coli | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=28953 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20140509-091507-9 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Englisch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Master of Science Thomas, Sabrina [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Schmitt, Lutz [Gutachter] Prof. Dr. Däubener, Walter [Gutachter] | |||||||
| Stichwörter: | RTX Toxin, HlyA, Type 1 Secretion, protein folding | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie | |||||||
| Beschreibungen: | Uropathogene E. coli (UPEC) sind die Hauptursache für Harnwegsinfektionen (HWI) in unserer Gesellschaft. Besonders Frauen sind prädestiniert für HWI, welche bei falscher Behandlung zu Schädigungen der Nieren oder sogar zum Tod führen können. Aufgrund der stetig steigenden Zahl resistenter UPEC Stämme wird ein molekulares Verständnis von HWI immer wichtiger, um auch in Zukunft eine effektive Behandlung zu gewährleisten.
Einer der Hauptvirulenzfaktoren von UPEC ist das Toxin Haemolysin A (HlyA), welches zur Familie der repeats in toxin (RTX) Proteine gehört. Die Sekretion von HlyA aus der bakteriellen Zelle erfolgt dabei über das dazugehörige Typ 1 Sekretionssystem, bestehend aus dem ABC Transporter HlyB, dem Membranfusionsprotein HlyD und dem äußeren Membranprotein TolC. Zwei Ereignisse sind notwendig, um das nicht toxische Vorläuferprotein pro-HlyA in das aktive Toxin zu überführen. Diese sind (i) eine Fettsäureacylierung an zwei bestimmten Lysinen, ausgeführt durch die Acyltransferase HlyC in Zusammenarbeit mit dem Acylträgerprotein (ACP) und (ii) die Bindung von Calcium Ionen an das RTX Motiv, welches zur Faltung des zuvor ungefaltenen Proteins führt. Obwohl diese Schritte essentiell für die Aktivität von HlyA sind, sind sie nur schlecht verstanden. Diese Doktorarbeit fokussiert sich auf drei folgenden Hauptpunkte: (I) Verständnis der HlyA Faltung nach Calcium-Ionen Bindung. Unter Verwendung von intrinsischer Tryptophan Fluoreszenz, sowie verschiedenen HlyA Mutanten und Ionen, wurde die Faltung von HlyA analysiert. Es konnte gezeigt werden, dass die Faltung von HlyA ein zweistufiger Prozess ist, der ein stabiles Faltungsintermediat beinhaltet und sich somit deutlich von der einstufigen Entfaltung unterscheidet. Hierbei spielt der C-terminale Proteinbereich eine essentielle Rolle, nicht nur durch Ca2+ Bindung durch das RTX Motiv, sondern für die übergreifende, korrekte Faltung des verbleibenden Proteins.Uropathogenic E. coli (UPEC) are the leading cause of urinary tract infections (UTI) in our modern society. Especially women are susceptible for UTI that can cause kidney damage or death if treated incorrectly. Due to increasing antibiotic resistance of UPEC strains, it is becoming more important to understand UTI on the molecular level to ensure future treatment. One major virulence factor of UPEC is the toxin haemolysin A (HlyA), belonging to the repeats in toxin (RTX) protein family. HlyA is secreted out of the bacterial cell by its corresponding Type 1 secretion system, consisting of the ABC transporter HlyB, the membrane fusion protein HlyD and the outer membrane protein TolC. Two events are necessary for HlyA to mature from a non-toxic precursor (pro-HlyA) to an active toxin. These are (i) a fatty acylation at two lysines, carried out by the acyltransferase HlyC together with the acyl carrier protein (ACP) and (ii) the binding of extracellular calcium ions to the RTX repeats leading to protein folding of the previously unfolded protein. Even though these steps are crucial for HlyA activity they are poorly understood. This doctoral research focusses on three major points: (I) Understanding of HlyA folding upon calcium ion binding. Using intrinsic tryptophan fluorescence, different HlyA mutants and ions, the folding of HlyA was analyzed. It could be shown that HlyA folding is a two-step mechanism with a clear folding intermediate and therefore clearly distinct from the one-step unfolding pathway. Here the C-terminal protein part plays a crucial role, not only in Ca2+ binding by the RTX repeats but for the overall, correct folding of the remaining protein. (II) Establishment of an in vitro acylation assay. For future analysis of HlyA activation by HlyC an in vitro assay was established using the previously purified proteins pro-HlyA, HlyC and ACP. The blood based assay is time efficient and easy to perform, allowing a quick scanning of future mutants of the involved proteins to identify important amino acids and also possible receptors for host cell interaction. (III) Crystallography of HlyA. To determine the 3D structure of HlyA and therefore gain information on important protein domains and amino acids, HlyA was crystallized and two promising crystallization conditions were identified. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Chemie » Biochemie | |||||||
| Dokument erstellt am: | 09.05.2014 | |||||||
| Dateien geändert am: | 09.05.2014 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 20.02.2014 | |||||||
| Datum der Promotion: | 18.03.2014 |
