Dokument: Biochemische und molekularbiologische Charakterisierung von Alkoholdehydrogenasen und einer Oxygenase aus Rhodococcus Spezies

Titel:	Biochemische und molekularbiologische Charakterisierung von Alkoholdehydrogenasen und einer Oxygenase aus Rhodococcus Spezies
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=2891
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20040721-000891-0
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Abokitse, Kofi [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 1,30 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 09.02.2007 / geändert 09.02.2007
Beitragende:	Prof. Dr. Hummel, Werner [Gutachter] Prof. Dr. Jaeger, Karl-Erich [Gutachter]
Stichwörter:	Rhodococcus, Alkoholdehydrogenase, Monooxygenase, Multikomponenten-Enzyme, chirale Alkoholen, Ketone, Gentransfer, Biotransformation
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibung:	Diese Arbeit beschreibt die Charakterisierung und das präparative Potential von reduktiven und oxidativen Enzyme in Rhodococcus-Stämmen. Als reduktive Enzyme wurden die Alkoholdehydrogenasen aus R. erythropolis (RE-ADH) und R. ruber (RR-ADH) untersucht. Beide Enzyme setzen stereospezifisch zahlreiche Ketone in die entsprechenden (S)-Alkoholen um und benötigen NADH als Coenzym. Die hohe Thermostabilität der ADHs, die üblicherweise mit einer hohen Lager- und operativen Stabilität einhergeht, stellt eine interessante Eigenschaft für ihre technische Anwendung dar. Für die Herstellung großer Mengen an Enzym wurde ein Expressionssystem, basierend auf einem selbstkonstruierten Vektor, entwickelt. Die RE-ADH zählt zu den Zink-enthaltenden Alkoholdehydrogenasen, die Supplementierung des Anzuchtmediums mit Zink führte zu einer weiteren Verbesserung der Expressionsausbeute. Mit Hilfe von Homologievergleichen wurde die Funktion des C-Terminus der RE-ADH aufgeklärt. Dabei wurden zwei Varianten der RR-ADH, die eine Mutation am C-Terminus tragen, erzeugt; diese Mutanten zeigen höhere enzymatische Aktivität. Dieser Bereich der beiden ADHs bestimmt im Wesentlichen die Reaktionsgeschwindigkeit, auf die Substratspezifität hat er nur einen geringen Einfluss. Die Untersuchung eines oxidativen Wegs befasste sich mit einer Monooxygenase aus R. ruber, die natürlicherweise den oxidativen Abbau von Tetrahydrofuran einleitet. Technologisch interessant ist, dass man durch diesen Schritt eine reaktionsträge C-H-Bindung durch Hydroxylierung aktiviert und damit für Reaktionen zugänglich macht. Monooxygenasen sind Multikomponenten-Enzyme, die aus einer Reduktase und einer Oxygenase bestehen. Im Rahmen dieser Arbeit konnten die Gene dieser Komponenten vollständig isoliert und identifiziert werden. Die Tetrahydrofuran-Monooxygenase (TMO) ist ein Enzym-Komplex, bestehend aus zwei Untereinheiten (α und β); die dafür kodierenden Gene wurden auf einem isolierten 8490 bp grossen DNA-Fragment lokalisiert. Zu diesem Enzym-Komplex gehört auch eine NAD-abhängige-Reduktase, die für die Übertragung von Reduktionsäquivalenten auf das Eisen-Oxo-Zentrum der Monooxygenase-Komponente notwendig ist. Die drei Gene (kodierend für die α-, β-Untereinheiten der Monooxygenase und die Reduktase) wurden kloniert und in E. coli exprimiert. Eine NADH-Reduktion durch diesen rekombinanten Enzym-Komplex wurde photometrisch detektiert. Diese NADH-Abnahme wurde durch FADH-Zusatz erhöht, was mit dem in der Reduktase gefundenen FAD-Bindungsmotiv übereinstimmt. Die Sequenzanalyse des 8490 bp DNA-Fragments gibt Informationen über die Evolution dieses Enzym-Komplexes. Offensichtlich ist das Gencluster für den Tetrahydrofuran-Abbau aus einem Mikroorganismus mit niedrigerem G+C Gehalt plasmidgebunden in Rhodococcus transferiert worden.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie
Dokument erstellt am:	21.07.2004
Dateien geändert am:	12.02.2007
Promotionsantrag am:	07.07.2004
Datum der Promotion:	07.07.2004