Dokument: Sekundärstoffe aus endophytischen Pilzen - Ansätze zur Aktivierung stiller Biosynthesewege, Strukturaufklärung und Bioaktivität

Titel:	Sekundärstoffe aus endophytischen Pilzen - Ansätze zur Aktivierung stiller Biosynthesewege, Strukturaufklärung und Bioaktivität
Weiterer Titel:	Natural Products from Endophytic Fungi: Approaches for Activation Silent Biosynthetic Pathways, Structure Elucidation and Bioactivity
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=28853
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20140331-123913-6
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Dr. rer. nat ola, Antonius [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 7,76 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 27.03.2014 / geändert 27.03.2014
Stichwörter:	Fungal Natural Product, Co-culture, Silent Biosynthetic Pathway
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Zusammenfassung Pilze sind produktive und reichhaltige Quellen strukturell diverser, bioaktiver Metabolite und haben einige der wichtigsten Produkte der pharmazeutischen Industrie hervorgebracht, wie z.B. das Penicillin. Da in fast allen vaskulären Pflanzen endophytische Pilze leben, stellen diese eine potentielle Quelle neuer Naturstoffe dar. Zusätzlich steigt das Interesse an der Entdeckung neuer Naturprodukte aus endophytischen Pilzen aufgrund steigender Resistenzen weltweit und dem daraus resultierenden Bedarf an neuen Antibiotika, Chemotherapeutika und agrochemischen Mitteln. Allerdings scheint es so zu sein, dass viele bioaktive Sekundärstoffe übersehen und nur ein Bruchteil isoliert werden, wenn der endophytische Pilz axenisch kultiviert wird. Diese Arbeit beschäftigt sich daher unter anderem mit Versuchen, die stillen Biosynthesewege zu aktivieren sowie mit der Strukturaufklärung von bioaktiven Sekundärstoffen aus Pilzen mit Fokus auf antibiotisch und zytotoxisch wirksamen Verbindungen. Da mikrobielle Interaktionen wichtig für die Aktivierung stiller Biosynthesewege sind, wurde der Versuch unternommen, durch die Co-Kultivierung von Pilzen und Bakterien die chemische Diversität von endophytischen Pilzen zu maximieren. Zusätzlich wurden epigenetische Modulatoren in Form von Inhibitoren der Histondeacetylasen (HDAC) und DNS-Methyltransferasen (DMATs) eingesetzt, um die Sekundärstoffproduktion endophytischer Pilze zu induzieren. Letztlich führte die Untersuchung von Monokulturen endophytischer Pilze zur Isolierung des antibiotisch wirksamen Neosartorins und der neuen Atropisomere Diaporthemin A und B. Diese Arbeit beinhaltet folgende drei Abschnitte, welche bereits veröffentlicht oder zur Publikation eingereicht wurden: Induktion der Produktion von Sekundärmetaboliten in endophytischen Pilzen durch Co-Kultivierung mit Bakterien Co-Kultivierung des Pilz-Endophyten Fusarium tricinctum mit dem Bakterium Bacillus subtilis 168 trpC2 auf festem Reismedium führte zu einer bis zu 78-fachen Zunahme der Akkumulation an konstitutiv vorhandenen Sekundärmetaboliten wie beispielsweise Lateropyron, zyklischen Depsipeptiden des Enniatin-Typs and des Lipopeptids Fusaristatin A. Weiterhin waren vier Verbindungen, darunter (–)-Citreoisocumarin sowie drei neue Naturstoffe lediglich in der Co-Kultivierung detektierbar, während sie in den separaten Pilz- und Bakterienkontrollen nicht auffindbar waren. Die neuen Verbindungen wurden mittels 1- und 2D-NMR-Spektroskopie und hochauflösender Massenspektrometrie (HRMS) als Macrocarpon C, 2-Carboxymethylaminobenzoesäure und (–)-Citreoisocoumarinol identifiziert. Enniatin B1 und A1, deren Produktion besonders gesteigert wurde, inhibitierten das Wachstum des co-kultivierten B. subtilis Stammes mit einer minimalen Hemmkonzentration (MHK) von 16 und 8 µg/mL und waren weiterhin aktiv gegen Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae und Entherococcus faecalis mit MHK-Werten im Bereich von 2-8 µg/mL. Außerdem zeigte Lateropyron, welches konstitutiv in F. tricinctum zu finden war, gute antibakterielle Eigenschaften gegen B. subtilis, S. aureus, S. pneumoniae und E. faecalis mit MHK-Werten zwischen 2-8 µg/mL. Alle antibakteriell wirksamen Verbindungen waren gleichwertig effektiv gegen multi-resistente klinische Isolate von S. aureus und einen empfindlichen Referenzstamm der gleichen Art. Absolute Konfiguration und antibiotische Aktivität von Neosartorin aus dem endophytischen Pilz Aspergillus fumigatiaffinis Neosartorin wurde aus dem endophytischen Pilz Aspergillus fumigatiaffinis isoliert. Die absolute Konfiguration von Neosartorin einschließlich axialer und zentral chiraler Elemente wurde mittels elektronischem Circulardichroismus (ECD) und unterstützenden TDDFT-ECD- Kalkulationen erstmalig als (aR,5S,10R,5’S,6’S,10’R) ermittelt. Neosartorin zeigte beachtliche antibakterielle Eigenschaften gegen ein breites Spektrum an grampositiven Bakterienspezies wie Staphylokokken, Streptokokken, Enterokokken und Bacillus subtilis mit MHKs im Bereich von 4-32 µg/mL. Bei Toxizitätsmessungen von Neosartorin gegen eukaryotische Zellen wie beispielsweise HELA und BALB/3T3 überstiegen die Durchschnittswerte 32 µg/mL. Dihydroanthracenon-Metaboliten aus dem endophytischen Pilz Diaporthe melonis isoliert aus Anonna squamosa Eine chemische Untersuchung des endophytischen Pilzes Diaporthe melonis, isoliert aus Anonna squamosa, führten zu den zwei neuen Dihydroanthracenon-Atropdiastereomeren Diaporthemin A und B zusammen mit dem bekannten Flavomannin-6,6’-di-O-methylether. Die Strukturen der neuen Verbindungen wurden anhand weitreichender 1- und 2D-NMR-Spektroskopie, hochauflösender Massenspektrometrie und CD-Spektroskopie etabliert. Die isolierten Verbindungen wurden auf ihre antimikrobielle Aktivität gegen multi-resistente klinische Isolate von Staphylococcus aureus 25697, einem empfindlichen Referenzstamm S. aureus ATCC 29213 und gegen Streptococcus pneumoniae ATCC 49619 getestet. Flavomannin-6,6’-di-O-methylether hemmte das Wachstum von S. pneumonia mit einer MHK von 2 µg/mL sehr stark und zeigte moderate Aktivität gegen das mult-resistente klinische Isolat und den empfindlichen Stamm von S. aureus (MHK 32 µg/mL), während Diaporthemin A und B gegen die getesteten Stämme inaktiv waren. Abstract Fungi are prolific and talented producers of structurally diverse bioactive metabolites and have yielded some of the most important products for the pharmaceutical industry such as penicillin. As almost all vascular plant species appear to be inhabited by endophytic fungi, the latter represent potential sources of novel natural products. Moreover, due to the world’s urgent need for new antibiotics, chemotherapeutic agents and agrochemicals, current research activities focus on natural product drug discovery from endophytic fungi. However, it seems that many valuable bioactive compounds are overlooked and only a minority of bioactive metabolites is usually isolated when culturing the endophytic fungi under axenic conditions. This dissertation is dealing with approaches to activate silent biosynthetic pathways and with the structure elucidation of fungal bioactive natural products focusing mainly on antibiotic and cytotoxic activities. As microbial interactions represent a significant factor for activation of silent biosynthetic pathways, an approach to maximize chemical diversity of endophytic fungi through coculture of fungi and bacteria was undertaken. In addition, inhibitors of histone deacetylases (HDAC) and DNA methyltransferases (DMATs) were also used to induce the secondary metabolite production of endophytic fungi. Moreover, investigation of bioactive metabolites from endophytic fungi under axenic culture conditions led to the isolation of the antibiotic compound neosartorin and of the new atropisomers diaporthemin A and B. This dissertation consists of the following three parts that have already been published or submitted for publication: Inducing secondary metabolites production by endophytic fungi through coculture with bacteria Co-culturing of the fungal endophyte Fusarium tricinctum with the bacterium Bacillus subtilis 168 trpC2 on solid rice medium resulted in an up to seventy-eight fold increase of the accumulation of constitutively present secondary metabolites that included lateropyrone, cyclic depsipeptides of the enniatin type, and the lipopeptide fusaristatin A. In addition, four compounds including (–)-citreoisocoumarin as well as three new natural products were not present in discrete fungal and bacterial controls and only detected in the co-cultures. The new compounds were identified as macrocarpon C, 2-(carboxymethylamino) benzoic acid, and (–)-citreoisocoumarinol by analysis of the 1D, 2D NMR, and HRMS data. Enniatins B1 and A1, whose production was particularly enhanced, inhibited the growth of the co-cultivated B. subtilis strain with minimal inhibitory concentrations (MICs) of 16 and 8 µg/mL, respectively, and were also active against Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae and Enterococcus faecalis with MIC values in the range of 2-8 µg/mL. In addition, lateropyrone, which was constitutively present in F. tricinctum displayed good antibacterial activity against B. subtilis, S. aureus, S. pneumoniae, and E. faecalis, with MIC values ranging from 2 to 8 µg/mL. All antibacterially active compounds were equally effective against a multi-resistant clinical isolate of S. aureus and a susceptible reference strain of the same species. Absolute configuration and antibiotic activity of neosartorin from the endophytic fungus Aspergillus fumigatiaffinis Neosartorin was isolated from the endophytic fungus Aspergillus fumigatiaffinis. The absolute configuration of neosartorin, including both axial and central chirality elements, was established as (aR,5S,10R,5’S,6’S,10’R) for the first time on the basis of its electronic circular dichroism (ECD) spectra aided with TDDFT-ECD calculations. Neosartorin exhibited substantial antibacterial activity against a broad spectrum of Gram-positive bacterial species including staphylococci, streptococci, enterococci and Bacillus subtilis with minimal inhibitory concentrations in the range of 4 to 32 µg/mL. When the toxicity of neosartorin against eukaryotic cells was measured using a panel of different cancer cell lines such as HELA and BALB/3T3, the average IC50 values exceeded 32 µg/mL. Dihydroanthracenone metabolites from the endophytic fungus Diaporthe melonis isolated from Anonna squamosa Chemical investigation of the endophytic fungus Diaporthe melonis, isolated from Anonna squamosa, yielded two new dihydroantharacenone atropodiastereomers, diaporthemins A and B, together with the known flavomannin-6,6’-di-O-methyl ether. The structures of the new compounds were established on the basis of extensive 1D and 2D NMR spectroscopy, as well as by high resolution mass spectrometry and by CD spectroscopy. The isolated compounds were tested for their antimicrobial activity against a multi-resistant clinical isolate of Staphylococcus aureus 25697, a susceptible reference strain of S. aureus ATCC 29213 and against Streptococcus pneumoniae ATCC 49619. Flavomannin-6,6’-di-O-methyl ether strongly inhibited S. pneumonia growth with a MIC value of 2 µg/mL and showed moderate activity against the S. aureus multi-resistant clinical isolate and susceptible reference strain (MIC 32 µg/mL), whereas diaporthemin A and B were not active against the tested strains.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Pharmazie » Pharmazeutische Biologie und Biotechnologie
Dokument erstellt am:	31.03.2014
Dateien geändert am:	31.03.2014
Promotionsantrag am:	13.01.0014
Datum der Promotion:	25.03.2014