Dokument: Functional Analysis of MDY2, a Novel Gene Required for Mating of the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Titel:	Functional Analysis of MDY2, a Novel Gene Required for Mating of the Yeast Saccharomyces cerevisiae
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=2883
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20080108-141701-6
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Hu, Zheng [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 9,13 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 15.02.2007 / geändert 15.02.2007
Beitragende:	Prof. Dr. Hollenberg, Cornelis P. [Gutachter] Prof. Dr. Lisowsky, Thomas [Gutachter] PD Dr. Ramezani-Rad, Massoud [Gutachter]
Stichwörter:	S. cerevisiae, Paarung, MDY2, Signaltransduktion, MAP-Kinasen, Protein-Interaktion, Funktionelle Genanalyse, Phosphorylierung, ProteinlokalisierungS. cerevisiae, Mating, MDY2, Signaltransduction, MAP-kinases, Protein-interaction, functional gene analysis, Phosphorylation, Protein localization
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Wenn man das Wissen über die Komponenten des Signalweges der Paarung und ihre Interaktionen vergleicht, kann man relativ wenigen Komponenten des Paarungsweges eine spezifische Rolle im Paarungsprozess zuordnen, obwohl die cytologischen Vorgänge der Paarung der Hefe schon gut beschrieben sind. Da bisher nur eine geringe Zahl an Genen für den Paarungsprozeß identifiziert wurden, könnte eine Suche nach neuen Genen, die für die Paarung erforderlich sind, neue Komponenten des Paarungsweges hervorbringen und somit helfen, die am Paarungsprozeß beteiligten molekularen und zellulären Mechanismen, weiter aufzuklären. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde eine semiquantitative Paarungsanalyse und ein Komplementationstest vorgenommen, um Gene zu finden, die für die Paarung der Hefe S. cerevisiae erforderlich sind. 38 Mutanten von 64 Einzelgendeletionsmutanten, die vom EUROFAN Projekt als Mutanten mit reduzierter Paarungseffizienz identifiziert wurden, wiesen eine signifikant reduzierte Paarungseffizienz auf. 15 Gendeletionsmutanten wurden hinsichtlich der Pheromonproduktion, der Pheromonantwort, der Morphogenese, der Zell- und Kernfusion charakterisiert. Der Defekt dieser Mutanten konnte dem Paarungsweg zugeordnet werden. Es konnten mit der Analyse zusätzliche Einblicke in den Paarungsprozess und über die Funktion der Gene gewonnen werden. Im zweiten Teil der Arbeit wurde das neue Gen MDY2, das für die Paarung der Hefe Saccharomyces cerevisiae erforderlich ist, ausgewählt und erstmals charakterisiert. Der ORF Yol111c des Genes MDY2 befindet sich auf dem Chromosom XV und kodiert für ein Protein, das aus 212 Aminosäuren besteht. Es enthält eine ubiquitin-ähnliche Domäne (UBL-Domäne). Das humane 157 Aminosäuren große Protein GdX weist die größte Homologie zu Mdy2 auf. Die phänotypische Analyse von mdy2 Deletionsmutanten deutete darauf hin, daß MDY2 für die Paarung der Hefe S. cerevisiae erforderlich ist und vor allem die Bildung der pheromoninduzierten Paarungsprojektionen und den Arrest des Zellzyklus in der G1-Phase beeinflußt. Die phänotypische Analyse der Überexpression von MDY2 bestätigte, daß MDY2 eine wichtige Rolle in der Regulation des Paarungspheromonweges einnimmt. Um die Funktion von MDY2 in dem Signaltransduktionsweg zu bestimmen, wurden in einem 2-Hybrid Test die möglichen Protein-Protein-Interaktionen zwischen Mdy2 und Proteinen, die in die Pheromonantwort involviert sind, untersucht. Die Ergebnisse der 2-Hybrid-Analyse zeigten, das Mdy2 in vivo mit den MAPKs Fus3 and Kss1, dem Gerüstprotein Ste5, der MAPKK Ste7 und Cdc24 interagiert. Die Untersuchung der subzellularen Lokalization von Mdy2 ergab, daß GFP-Mdy2 im Nukleus von vegetativ wachsenden Zellen verteilt ist. Zellen, die mit alpha-Faktor behandelt wurden wiesen eine vorwiegend nukleare Lokalisation von GFP-Mdy2 auf, mit einer sehr kleinen Fraktion, die in den Paarungsprojektionen akkumulierte. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, daß Mdy2 mit den Proteinen Fus3, Ste5, Ste7, Kss1, and Cdc24 im Zellkern interagiert. Ergebnisse des 2-Hybrid-Testes und einer Pulldown-Analyse zeigten an, daß Mdy2 spezifisch mit der MAPK Fus3 interagiert. Unterschiede in der Modifikation von einem Myc-Fus3 Fusionsprotein im Wildtypstamm und in der mdy2 Mutante deuten an, daß Mdy2 wahrscheinlich für die Stabilisierung der phosphorylierten MAPK Fus3 im Pheromonweg von S. cerevisiae erforderlich ist. The cytological events of yeast mating have been well described but, in comparison with our knowledge of the components of the mating signal transduction cascade and their interactions, relatively few components are known to be specifically involved in the later events in the mating process. The limited number of genes currently identified as functioning in these processes suggested that a search for new genes required for mating might yield additional components of the mating pathway, and thereby help to determine the molecular and cellular mechanism involved in the mating process. In the first part of this study, a semi-quantitative mating analysis and complementation tests were performed to identify new genes required for mating in the yeast S. cerevisiae. 38 out of 64 single gene deletion mutants selected during EUROFAN project for reduced mating efficiency indeed showed significantly reduced mating efficiency in the mating assay. More detailed characterization of 15 of these mutants with respect to pheromone production, pheromone response, morphogenesis, cell fusion and nuclear fusion yielded insight into the precise steps affected by these mutations. MDY2, one of genes identified in the first part of study, was then characterized in more detail. MDY2 is located on chromosome XV and encodes a protein of 212 amino acids. It contains an ubiquitin-like domain (UBL-domain). The closest homologue of MDY2 is the 157 amino acid human protein GdX. Phenotypic analysis of mdy2 deletion mutants suggests that MDY2 is required for mating in S. cerevisiae and mainly influences the pheromone induced formation of the mating projection and, to a lesser extent, the pheromone-dependent arrest of the cell cycle in G1. The phenotypic analysis of the effects of overexpression of MDY2 confirmed that MDY2 plays an important role in the regulation of the pheromone response pathway. To determine whether and where MDY2 functions within the signal transduction pathway, possible protein-protein interactions between Mdy2 and proteins involved in the mating pheromone response pathway were investigated using two-hybrid assays. The results indicated that Mdy2 may interact in vivo with the MAPKs Fus3 and Kss1, the scaffold protein Ste5, the MAPKK Ste7, and Cdc24. In a pull down analysis, Mdy2 was shown to interact specifically with the MAPK Fus3. An analysis of the modification of the Myc-Fus3 fusion protein in response to pheromone in the mdy2 mutant suggests that Mdy2 probably influences the stability of the phosphorylated form of Fus3. Investigation of the subcellular localization of Mdy2 showed that GFP-Mdy2 is localized in the nucleus of vegetative growing cells. In cells treated with alpha-factor, GFP-Mdy2 is predominantly nuclear, but a very small fraction is dispersed in the mating projections. These results suggest that Mdy2 may interact with Fus3 in the nucleus.
Rechtliche Vermerke:	aus patentrechtlichen Gründen bis 01.01.2008 zurückgestellt
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie
Dokument erstellt am:	16.07.2004
Dateien geändert am:	15.02.2007
Promotionsantrag am:	25.05.2004
Datum der Promotion:	25.05.2004