Dokument: Biochemische und physiologische Charakterisierung der Subtilase SprP aus Pseudomonas aeruginosa

Titel:	Biochemische und physiologische Charakterisierung der Subtilase SprP aus Pseudomonas aeruginosa
Weiterer Titel:	Biochemical and physiological characterization of the subtilase SprP of Pseudomonas aeruginosa
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=28802
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20140328-112824-5
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Pelzer, Alexander [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 6,55 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 24.03.2014 / geändert 24.03.2014
Beitragende:	Prof. Dr. Jaeger, Karl-Erich [Gutachter] Prof. Dr. Bott, Michael [Gutachter]
Stichwörter:	Pseudomonas aeruginosa, Protease, SprP
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Das ubiquitäre und äußerst vielseitige Bakterium Pseudomonas aeruginosa ist aufgrund seiner humanpathogenen Eigenschaften sowie seines Potenzials zur Produktion von Enzymen und Metaboliten von übergeordnetem wissenschaftlichen Interesse. Zur Pathogenität des Bakteriums tragen die Produktion zahlreicher Virulenzfaktoren, die schnelle Anpassung an diverse Umweltbedingungen und die hohe intrinsische Resistenz gegenüber Antibiotika bei. Diese Eigenschaften werden über eines der komplexesten bekannten bakteriellen Regulationsnetzwerke vermittelt. Die Regulation zellulärer Prozesse findet jedoch nicht ausschließlich über die Regulation der Genexpression statt, sondern auch auf Proteinebene über eine Protease-vermittelte Regulation. Bakterielle Proteasen übernehmen dabei häufig Schlüsselrollen, indem sie u. a. missgefaltete Proteine degradieren und die Konzentration von Chaperonen, Transkriptionsregulatoren sowie Sigmafaktoren kontrollieren. Die Protease SprP ist ein neuer, sehr ungewöhnlicher Protease-Vertreter, deren umfassende Charakterisierung im Mittelpunkt dieser Arbeit stand. Anhand detaillierter in silico Analysen konnte das modular aufgebaute Enzym einer neuen Subtilase-Familie zugeordnet werden, die im Wesentlichen nur in Pseudomonaden zu finden ist. Diese Familie zeichnet sich insbesondere durch eine große N-terminale Domäne unbekannter Funktion (DUF) aus, für deren Funktion als Propeptid zur autokatalytischen Aktivierung der Protease, hier erste Hinweise erzielt werden konnten. SprP ließ sich nicht durch konventionelle Expressionsmethoden funktional darstellen. Die lösliche und aktive Produktion konnte nur mithilfe eines neuartigen E. coli Typ I-Sekretionssystems auch im präparativen Maßstab erfolgreich durchgeführt werden. Darüber hinaus gelang auch eine Optimierung der Reinigungsmethode mittels Affinitätschromatographie. Durch in vitro Experimente mit gereinigtem Protein konnte erstmals die autokatalytische Prozessierung nachgewiesen werden. Das Molekulargewicht des aktiven SprP-Enzyms wurde nach Größenausschlusschromatographie mit ca. 26 kDa bestimmt. Die biochemische Analyse ergab, dass die optimale enzymatische Aktivität von SprP in vitro bei einer Temperatur von 50 °C sowie einem pH-Wert von 7 - 8 erreicht wird. Durch Inhibitionsstudien und Analyse von in dieser Arbeit rational erzeugten SprP-Varianten konnte gezeigt werden, dass SprP eine Serinprotease ist und zu der selteneren E-H-S Familie der Subtilasen gehört. Zur Erstbeschreibung der Spezifität von SprP wurde eine Peptidbibliothek verwendet und das Substratspektrum auf Peptide eingegrenzt, deren Erkennungssequenzen basische und hydrophobe Aminosäuren aufweisen. Umfangreiche sprP-Expressionsstudien demonstrierten, dass die Promotoraktivität von sprP als Reaktion auf Temperaturstress induziert wird. SprP ist somit ein Bestandteil der Stressantwort von P. aeruginosa. Der Vergleich der Eigenschaften eines sprP-defizienten Stammes mit einem P. aeruginosa Wildtyp war die Grundlage dafür, SprP eine globale physiologische Rolle zuzuweisen. Durch systembiologische Proteom- und Transkriptomanalysen konnte die übergeordnete physiologische Funktion von SprP eindrucksvoll untermauert werden. Allein durch Transkriptomanalysen konnte erstmals gezeigt werden, dass die sprP-Deletion die differenzielle Expression von 218 Genen zur Folge hat. Die umfassende Analyse weiterer pleiotroper Auswirkungen der sprP-Deletion machte die Funktion der Subtilase SprP in P. aeruginosa deutlich. Die Deletion des Subtilase-Gens führt (I) zu einer starken Zellaggregation von P. aeruginosa während der Flüssigkultivierung, (II) zu einer erhöhten Biofilmproduktion, (III) zu dem Verlust der Beweglichkeit, (IV) zu einem reduzierten Wachstum unter anaeroben Bedingungen, (V) zu einer erhöhten Rhamnolipidproduktion sowie (VI) zu einer erhöhten Pyoverdinproduktion. Die systematischen Untersuchungen der Subtilase SprP veranschaulichen hier erstmalig, dass dieser Protease eine bedeutende Funktion innerhalb des komplexen Regulationsnetzwerkes von P. aeruginosa zukommt. Als regulatorische Protease stellt SprP ein neues bedeutendes Mitglied dieses Netzwerkes dar, das in P. aeruginosa und vermutlich auch in anderen Pseudomonaden an der Kontrolle diverser zentraler zellulärer Prozesse beteiligt ist. The ubiquitous and versatile bacterium Pseudomonas aeruginosa is of great scientific interest due to its pathogenicity and the capability to produce enzymes and metabolites. The pathogenicity is largely caused by the production of an arsenal of virulence factors, a rapid adaptation to several environments and a high intrinsic level of antibiotic resistance. These properties are regulated by one of the most complex bacterial regulatory networks known. The regulation of cellular processes is carried out not only on gene expression level but also on protein level by regulatory proteases. Bacterial proteases often play key roles in this process for instance by degradation of misfolded proteins and controlling the concentration of chaperones, transcriptional regulators and also sigma factors. The protease SprP is a novel, uncommon representative of proteases whose extensive characterization is the main focus of this work. By the means of detailed in silico analysis, it was possible to assign this modular structured enzyme to a family of novel subtilases that is found primarily in pseudomonads. This newly identified family is characterized by a large N-terminal domain of unknown function (DUF). It was possible to obtain reasonable indications that this domain possibly functions as propeptide for autocatalytic activation of the protease. The functional production of SprP could not be attained using conventional expression systems. The soluble and active production on a preparative scale has been achieved by means of a novel E. coli type I secretion system. Furthermore, the purification was optimized by employing affinity chromatography. In vitro experiments with the purified protein demonstrated the autocatalytic processing for the first time. The molecular weight of the active SprP enzyme was determined after size exclusion chromatographie analysis as approximately 26 kDa. The biochemical analysis showed that the optimal in vitro enzyme activity of SprP is reached at a temperature of 50 °C and pH values between 7 - 8. Inhibitor studies and the analysis of rational designed SprP variants revealed that SprP belongs to the serine proteases and to the less common E-H-S family of subtilases. For an initial description of the SprP specificity, a peptide library was used and the substrate specificity was found to be for peptides whose recognition sequence is composed of basic and hydrophobic amino acids. Extensive sprP expression studies demonstrated that the promoter activity of sprP is induced as reaction to temperature stress. Consequently, SprP is part of the stress response of P. aeruginosa. The comparative analysis of a sprP mutant strain with a P. aeruginosa wild type formed the basis for the investigation of the global physiological role of SprP. By means of systems biology approaches like proteome and transcriptome analyses, the idea of a general physiological function of SprP was strongly supported. The transcriptome analysis alone demonstrated that the deletion of sprP results in the altered expression of 218 genes. The extensive analysis of further pleiotropic consequences of the sprP deletion clearly illustrated the function of the subtilase SprP in P. aeruginosa. The deletion of the subtilase encoding gene resulted in (I) a strong cell aggregation of P. aeruginosa during growth in liquid cultures, (II) an increased biofilm production, (III) the loss of motility, (IV) a reduced growth under anaerobic conditions, (V) an increased production of rhamnolipids as well as (VI) an increased production of pyoverdines. For the first time, the systematic investigation of the subtilase SprP illustrated that this protease plays a critical role within the complex regulatory network of P. aeruginosa. As a regulatory protease, SprP represents a new and important network member that is responsible for the control of several central cellular processes in P. aeruginosa and probably in other pseudomonads as well.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Enzymtechnologie
Dokument erstellt am:	28.03.2014
Dateien geändert am:	28.03.2014
Promotionsantrag am:	05.11.2013
Datum der Promotion:	19.12.2013