Dokument: Vergleich der Oligopeptidpermeasen dreier verschiedener Mycoplasma hominis Isolate und Etablierung eines Infektionsassays zur weitergehenden Charakterisierung

Titel:	Vergleich der Oligopeptidpermeasen dreier verschiedener Mycoplasma hominis Isolate und Etablierung eines Infektionsassays zur weitergehenden Charakterisierung
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=28731
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20140319-120001-8
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Dahlmanns, Theresa [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 1,31 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 18.03.2014 / geändert 18.03.2014
Beitragende:	Prof. Dr. Henrich, Birgit [Gutachter] Prof. Dr. Fritz, Gerhard [Gutachter]
Stichwörter:	Mycoplasma hominis
Dewey Dezimal-Klassifikation:	600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften » 610 Medizin und Gesundheit
Beschreibung:	Im Rahmen meiner Dissertation habe ich zunächst zwei OppA-Varianten der Oligopeptidpermease von Mycoplasma hominis Isolaten untersucht. Eine davon, OppA64, wies Unterschiede in der Antigenität, die andere, OppA66, Unterschiede in der apparenten Größe im Vergleich zum bereits gut charakterisierten OppAFBG auf. Durch Sequenzierung der oppA64 -und oppA66 –Gene konnte der Grund für den Verlust des TF6-Epitops bei OppA64 gefunden werden, der durch eine Punktmutation (E176V) entsteht. Der apparente Größenunterschied von OppA66 zu den OppA-Proteinen aller anderen Isolate hat seine Ursache nicht in Geninsertionen. Mit Hilfe von internetbasierten Softwareprogrammen wurde die OppA66 Proteinsequenz auf zusätzliche posttranslationale Modifikationen und Unterschiede der Sekundärstruktur untersucht. Hier ließen sich geringe Unterschiede zu OppAFBG feststellen, so dass für den apparenten Größenunterschied im SDS-PAGE ein verändertes Laufverhalten von OppA66 verantwortlich sein wird, das durch diese detektierten Veränderungen in der Sekundärstruktur bedingt sein kann. Im zweiten Teil der Arbeit wurde der Grund für die zusätzliche 3,3 kb oppA Bande zu der polycistronischen 9,5 kb oppABCDF-Bande, im Nothern Blot (Henrich et al., 1999) untersucht. Mittels Southern Blot Analyse konnte ich nachweisen, dass oppA ein single-copy Gen ist und somit einen zweiten Genlokus als Ursache für die 3,3 kb Bande ausschließen. Zur Analyse, unter welchen patho-physiologischen Bedingungen oppA nicht nur polycistronisch mit oppBCDF, sondern auch monocistronisch exprimiert wird, habe ich einen Infektionsassay etabliert, bei dem HeLa-Zellen mit M. hominis FBG inkubiert, und anschließend RNA und DNA präpariert und in qPCR Analysen gemessen werden. Bei der Testung verschiedener RNA-Präparationsmethoden stellte sich die Extraktion mit dem RNeasy Mini Kit von Qiagen als die Beste heraus. Es erwies sich allerdings als nötig, die RNA vor der reversen Transkription mit DNase I zu behandeln, da die Kontamination mit DNA sehr hoch war. Durch die DNA Präparation aus einem Aliquot der lysierten Zellen mit dem Bio-Roboter EZ1 konnte die Transkriptmenge (RNA) auf die Genomäquivalente (DNA) bezogen werden. Dank der Plasmid-klonierten PCR Amplikons als Quantifizierungsstandards konnten die Zielgene absolut quantifiziert werden und durch den Einsatz von Referenzgenen war die Bestimmung der mittleren Expression der Zielgene möglich. So wurde im Rahmen dieser Arbeit ein in vitro Infektionsmodell für M. hominis etabliert und in ersten Analysen die These bestätigt, dass oppA besonders zu Beginn der Infektion monocistronisch und polycistronisch als oppABCDF transkribiert wird.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Medizinische Fakultät
Dokument erstellt am:	19.03.2014
Dateien geändert am:	19.03.2014
Promotionsantrag am:	14.12.2012
Datum der Promotion:	26.02.2014