Dokument: Biochemical studies on Pdr5 - an ABC transporter from Saccharomyces cerevisiae

Titel:	Biochemical studies on Pdr5 - an ABC transporter from Saccharomyces cerevisiae
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=28610
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20140306-124613-0
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Mr. Gupta, Rakeshkumar [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 37,76 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 06.03.2014 / geändert 06.03.2014
Beitragende:	Prof. Dr. Schmitt, Lutz [Gutachter] Prof. Dr. Georg Groth [Gutachter]
Stichwörter:	ABC transporter, multidrug resistance, membrane protein
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 540 Chemie
Beschreibungen:	Pdr5 ist ein ABC (ATP-binding cassette) -Transporter aus Saccharomyces cerevisiae, der eine Schlüsselstellung im Phänomen der pleiotropen Drogenresistenz (PDR) einnimmt. Seine primäre Funktion besteht darin Hefezellen durch aktive Ausschleusung toxischer Verbindungen zu schützen. Um diese lebenswichtige Funktion zu erfüllen nutzt Pdr5 ATP als Energiequelle, das durch zytosolische Nukleotidbindedomänen (NBDs) gebunden und hydrolysiert wird. ’Full size’ ABC-Transporter wie Pdr5 besitzen zwei dieser Domänen, die jeweils ein ATP Molekül binden können. Im Gegensatz zu humanen ABC-Transportern besitzt Pdr5 eine sogenannte degenerierte Nukleotidbindungsstelle (NBS) und eine kanonische Bindungsstelle. Pdr5 und andere ABC-Transporter der Hefe sind daher nicht in der Lage in der degenerierten Bindungsstelle ATP zu hydrolysieren. Um die Relevanz dieser Degenerierung molekular zu analysieren, wurden die nicht-kanonischen Aminosäuren der degenerierten Bindungsstelle zu ihren konservierten Analoga mutiert. Anschließend wurden die Auswirkungen auf die Zellviabilität in Gegenwart toxischer Verbindungen und auf die in vitro Aktivität von Pdr5 analysiert. Dabei zeigte sich eine erhöhte Sensitivität gegenüber Drogen, eine drastisch reduzierte ATPase-Aktivität und ein fehlender Substrattransport. Diese Ergebnisse belegen, dass die Einführung einer zweiten, künstlichen Konsensussequenz die Funktion von Pdr5 komplett inhibiert. Damit wird die Hypothese unterstützt, dass während der Evolution der Hefe die ABC Transporter eine degenerierte NBS entwickelten, die als strukturelle Plattform der ATP-Hydrolyse fungiert. Auch lässt sich somit die hohe basale ATPase-Aktivität erklären, denn die Degeneration stellt den funktionalen Zustand von Pdr5 zu Jederzeit sicher. Der zweite Teil der Dissertation beschäftigt sich mit der Bestimmung der Stöchiometrie des rhodamin 6g Transports in Pdr5 Membranvesikeln und der dafür benötigen Anzahl hydrolysierter ATP Moleküle. Die Kopplung der ATP-Hydrolyse mit dem Substrattransport als Grundlage dieses Prozesses ist ein wesentliches Merkmal von ABC Transportern. Die meisten menschlichen ABC Transporter besitzen eine strikte, energetische Kopplung und zeigen Substrat-stimulierte ATPase Aktivität. Pdr5 hingegen ist ein entkoppelter Transporter, für den bisher keine Substratstimulation gezeigt werden konnte. Für das fluoreszierende Substrat rhodamin 6g wurde durch Messung des benötigten ATP die Stöchiometrie des Transportes quantitativ bestimmt, dabei wurde ein Verhältnis von 0.3 mol transportiertem Substrat pro mol hydrolysiertem ATP ermittelt. Jedoch ist dieses Verhältnis stochastischer Natur und wird durch die Wahrscheinlichkeit bestimmt, ob der entkoppelte Transporter Pdr5 während eines Hydrolyseszyklus auf ein Substrat trifft. Die rhodamin 6g Konzentration, bei der eine maximale Stöchiometrie bestimmt wurde, beträgt 600 nM. Eine weitere Erhöhung der Substratkonzentration wirkt sich hemmend auf die Aktivität aus und reduziert das stöchiometrische Verhältnis. Der dritte und letzte Teil der Arbeit widmet sich der Bestimmung alternativer Mechanismen der Drogenresistenz, die bei einzelnen Mutanten von Pdr5 auftraten. Bei Mutanten der Pdr5 NBD wurde eine erhöhte Resistenz gegenüber rhodamin 6g in Flüssigkultur-Assays festgestellt. Diesen fehlte aber jegliche Funktionalität und damit konnten sie auch nicht den Transport von rhodamin 6g katalysieren. Dies wird durch Laser-Scan-Mikroskop Messungen unterstützt. Um die Ursachen dieses völlig unerwarteten Verhaltens zu bestimmen, wurden Proteomanalysen des Wildtyps und der entsprechenden Mutante durchgeführt. In Gegenwart von rhodamin 6g konnte in der Mutante eine Erhöhung der Glykolyse und eine verringerte mitochondriale Aktivität bestimmt werden. Diese Ergebnisse wurden mit Untersuchungen in Gegenwart unterschiedlicher Glukosekonzentrationen verifiziert. Hier wies die Mutante ein verbessertes Wachstums bei niedriger (1%) und hoher (3-4%) Glukosekonzentration auf. Erste Ergebnisse belegen, dass Änderungen in der post-translationalen Modifikation von Pdr5 vorliegen, die eine Wechselwirkung mit anderen (Membran)proteinen induzieren könnten. Abschließend kann diese Dissertation in drei essentiellen Punkten zusammengefasst werden: 1. Die degenerierte Nukleotidbindungsstelle in Hefe ABC transportern stellt eine strukturelle Plattform dar. 2. Die stochastische Stöchiometrie des durch Pdr5 vermittelten rhodamin 6g Transports in Membranvesikeln beträgt maximal 0.3. 3. Spezifische Mutanten von Pdr5 führen zu alternativen Mechanismen der Drogenresistenz in Gegenwart von rhodamin 6g. Pdr5 is an ATP binding cassette (ABC) transporter from Saccharomyces cerevisiae involved in the phenomena of pleiotropic drug resistance (PDR). Its primary function is to protect the yeast cell by pumping out toxic compounds to the extracellular surface. To carry out its function Pdr5 utilizes ATP as an energy source, which is bound and hydrolyzed intracellularly by the nucleotide binding domains (NBDs). Full size ABC transporters such as Pdr5 possess two such domains that are capable of binding two ATP molecules. Unlike most human ABC transporters Pdr5 possesses one degenerate nucleotide binding site (NBS) and one canonical binding site. This feature renders Pdr5 and other yeast ABC transporters unable to hydrolyze ATP at the degenerate site. To understand the relevance of this degeneracy we mutated the non-consensus amino acid residues with their consensus counterparts and studied the impact on cell survival when challenged with toxic compounds and in vitro activity of Pdr5. Our findings suggest that artificially introducing a second consensus site completely disrupts Pdr5 function, which is displayed by increased drug sensitivity, drastically reduced ATPase activity and no substrate transport. This supports our hypothesis that yeast ABC transporters have evolved and maintained a degenerate NBS that function as a structural platform for ATP hydrolysis to take place at the consensus site. This would also explain the high level basal ATPase activity, which keeps Pdr5 active at all the times to pump out substrate immediately upon encountering it. Second part of the work deals with determining stoichiometry of rhodamine 6g transport mediated by Pdr5 in crude membrane vesicle preparations. Coupling of ATP hydrolysis to substrate transport is an essential feature of ABC transporter function. Most human ABC transporters have a strict coupling and display substrate stimulated ATPase activity. Pdr5 on the other hand is an uncoupled transporter and has so far not displayed any substrate stimulation. We tried to determine the stoichiometry of transport of a fluorescent substrate rhodamine 6g by measuring the amount of ATP hydrolyzed while transport is being quantitatively measured. The ratio we obtained was 0.3 moles of substrate transported per mole of ATP hydrolyzed. But this ratio was stochastic in the sense that Pdr5 being an uncoupled transporter it is only a matter of chance that it encounters a substrate during ATP hydrolysis. The optimum rhodamine 6g concentration was determined to be 600nM beyond which the substrate becomes inhibitory to protein activity and reduces the stoichiometric ratio. The third and last part of the work was focussed on determining alternate mechanisms of drug resistance in particular mutants of Pdr5. It was observed with some NBD mutants of Pdr5 that they display increased resistance towards rhodamine 6g in liquid drug assays when compared to the wildtype protein. But, these mutants lacked functional Pdr5 and were incapable of transporting rhodamine 6g. This is supported by laser scanning confocal microscopy data that displays accumulation of the fluorescent dye within the cells of these mutants, who can withstand twice as much rhodamine 6g as compared to the wildtype cells. To determine the reason for this behaviour we subjected the mutants to complete proteome analysis and discovered that in the presence of rhodamine 6g the mutants have significantly higher up-regulation of glycolytic enzymes in the background of lack of mitochondrial function. These results are supported by liquid drug assays with varying glucose concentrations where the mutants display higher efficiency in growth at lower (1%) and higher (3-4%) glucose concentrations than the wildtype cells. It also points in the direction of post-translational modifications of Pdr5 that might be involved in its interaction with other membrane proteins and in turn lead to glucose import within the cells. In short the entire work can be summarized in three points: 1. The degenerate nucleotide binding site in yeast ABC transporters functions as a structural platform. 2. The stochastic stoichiometry for rhodamine 6g transport mediated by Pdr5 in membrane vesicles is 0.3. 3. Specific mutants of Pdr5 display alternate mechanisms of drug resistance in the presence of rhodamine 6g.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Chemie » Biochemie
Dokument erstellt am:	06.03.2014
Dateien geändert am:	06.03.2014
Promotionsantrag am:	23.01.2014
Datum der Promotion:	26.02.2014