Dokument: Funktionelle Charakterisierung der Kolokalisation von Guanylat-bindenden Proteinen (GBPs) mit intrazellulären Erregern

Titel:	Funktionelle Charakterisierung der Kolokalisation von Guanylat-bindenden Proteinen (GBPs) mit intrazellulären Erregern
Weiterer Titel:	Functional characterization of the colocalization of GBP proteins with intracellular pathogens
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=28461
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20140220-105627-9
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Kluempers, Verena [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 14,29 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 20.02.2014 / geändert 20.02.2014
Beitragende:	Prof. Dr. Pfeffer, Klaus [Gutachter] Prof. Dr. Ernst, Joachim F. [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Interferon γ (IFNγ) ist eines der wichtigsten Zytokine, für die Vermittlung der Resistenz gegen intrazelluläre Parasiten vermitteln. Nach IFNγ Stimulation werden in der Zelle verschiedene GTPasen hochreguliert, inklusive der p65 Guanylate-bindenden Proteine (GBPs). In den vergangenen Jahren konnte in unserer Arbeitsgruppe gezeigt werden, dass verschiedene mGBPs nach IFNγ Stimulation und Toxoplasma gondii Infektion eine Lokalisationsänderung in der Zelle aufweisen. Sie rekrutieren von ihrer ursprünglichen Vesikel-ähnlichen Verteilung im Zytoplasma um die parasitophore Vakuole (PV) des Parasiten herum. Dies implizierte eine anti-parasitäre Funktion für die mGBPs in der Zelle, die in Infektionsversuchen mit der bereits generierten mGBP2-/- Maus bestätigt werden konnte. Die mGBP2-defiziente Mauslinie zeigt eine erhöhte Suszeptibilität, charakterisiert durch eine erhöhte Anzahl von T. gondii Gewebezysten im Gehirn und erhöhter Mortalität im Verlauf der Infektion. Ziel dieser Arbeit war es, zelluläre Mechanismen genauer zu charakterisieren, die zu der Akkumulation der mGBPs um die parasitophore Vakuole (PV) herum führen. Des Weiteren sollten Proteindomänen beschrieben werden, die für die Akkumulation an der PV wichtig sind. Die mGBP2-/- Maus sollte im parasitären (T. gondii) und viralem (MCMV) Infektionsmodell genauer charakterisiert werden. Es zeigte sich, dass die Akkumulation von mGBP2 an die PV unabhängig vom Toll-like Rezeptor (TLR) Adapterprotein MyD88 ist, sodass die mGBP Rekrutierung wahrscheinlich TLR unabhängig erfolgt. Auch eine Abhängigkeit der Rekrutierung von MAP-Kinase (Mitogen aktivierte Protein Kinase) konnte nicht gezeigt werden. Obwohl die Infektion mit T. gondii Veränderungen im intrazellulären Ca2+-Level auslöst, konnte keine Ca2+-Abhängigkeit der mGBP Rekrutierung gezeigt werden. Eine wichtige Effektor-Funktion von mGBP2 im Prozess des PV Abbaus zeigte sich in Immunfluoreszenz-Versuchen mit Hilfe einer selektiven Permeabilisierung. Es konnte beobachtet werden, dass es bei mGBP2 positiven PVs zu einer Durchlässigkeit der PV-Membran für einen T. gondii spezifischen Antikörper kommt, die nicht durch den Einsatz des Detergenz erklärt werden kann. Vergleichbares konnte bei mGBP2 negativen PVs nicht beobachtet werden und ebenfalls nicht nach Infektion mit virulenten BK Toxoplasmen, die eine Rekrutierung von mGBPs um ihre PV verhindern können. Live cell imaging Aufnahmen zeigten, dass mGBP2 Vesikel einen hohen Grad an Dynamik aufweisen. Schon vor Infektion zeigen sich verschiedene dynamische Prozesse, wie Verschmelzungen und Abspaltungen von Vesikeln untereinander. Nach Infektion mit T. gondii konnte die schnelle Akkumulierung von mGBP2 um die PV beobachtet werden. Es zeigte sich, dass weniger ganze Vesikel zielgerichtet an die PV rekrutieren, sondern es sich um verschiedenste dynamische Prozesse handelte. Zum einem verschmolzen Vesikel mit der PV, lösten sich aber auch wieder ab. Viele Vesikel in PV Nähe wurden kleiner, sodass es wahrscheinlich ist, dass mGBP2 aus den Vesikeln entlassen wird und in freier Form an die PV rekrutiert. Diese Beobachtungen stimmen auch mit Ergebnissen verschiedener Zytoskelett-Inhibitionen überein. Auch nach Einsatz verschiedener Inhibitoren kam es zu einer Akkumulation von mGBP2 an die PV. Dies lässt die Schlussfolgerung zu, dass die Akkumulation von mGPBS um die PV unabhängig vom Zytoskelett erfolgt. Es kann allerdings nicht ausgeschlossen werden, dass die Bewegungen der mGBP2 Vesikel innerhalb der Zelle Zytoskelett abhängig sind und nur die Dissoziation von mGBP2 Molekülen aus den Vesikeln zu der PV Zytoskelett unabhängig erfolgt. Es zeigte sich, dass die Akkumulation von mGBP2 an die PV von ATG5 abhängt. In ATG5-/- Zellen kam es zu einer verringerten Akkumulation von mGBP2 an der PV. ATG5 ist bedeutend für die Membranelongation während der Autophagie und könnte somit auch für die Rekrutierung maßgeblicher Effektor-Moleküle (wie den mGBPs) während einer Infektion, im Rahmen der Autophagie als Abwehrmechanismus gegen intrazelluläre Parasiten, wichtig sein. Wir vermuten einen ATG5-abhängigen, aber Autophagie-unabhängigen Mechanismus, der für den Transport wichtiger Effektorproteine wie die mGBPs an die PV von T. gondii verantwortlich ist. Für die Aufklärung wichtiger Motive bzw. Aminosäuren in der mGBP Sequenz, die zu der Rekrutierung an die T. gondii PV führen, wurde ein Hybridprotein zwischen mGBP6 und mGBP10 hergestellt. Diese Mitglieder der mGBP-Familie sind besonders interessant, denn sie unterscheiden sich nur in 14 Aminosäuren. Während mGBP6 an die PV von T. gondii rekrutiert kann mGBP10 dies nicht. Mit Hilfe des Hybridproteins und Mutagenese Versuchen konnte eine für die Rekrutierung wichtige Aminosäure im C-Terminalen Proteinteil identifiziert werden (D542N). Des Weiteren zeigte sich, dass die Rekrutierung der mGBPs nach Infektion mit virulenten T. gondii Stämmen, wie Typ I BK-Toxoplasmen, durch Rhoptrien Proteine (ROP) verhindert wird. Nach Inhibition der ROP Sezernierung, konnte eine steigende Anzahl von mGBP2 positiven PVs um virulente BK Toxoplasmen herum detektiert werden. Eine neue Funktion von mGBP2 in der Abwehr von viralen Infektionen konnte durch Infektionsversuche von mGBP2-/- Mäusen mit mCMV beschrieben werden. Hier zeigten die mGBP2-/- eine erhöhte Viruslast in den Organen nach Infektion im Vergleich zu WT Tieren. Interferon-y (IFNy) is a major cytokine that mediates resistance against intracellular parasites. After IFNy stimulation several GTPases are upregulated in cells, including the p65 guanylate-binding proteins (GBPs). In recent years our group could show, that several mGBPs relocalize after Toxoplasma gondii infection from their former vesicular-like structure to the parasitophorous vacuole (PV) of the parasite, indicating an anti-parasitic role for the mGBPs within the cell. This was demonstrated in infection experiments in the mGBP2-/-mice; which showed an increased susceptibility against T. gondii infection, characterized by a higher amount of T. gondii containing cysts in the brain and an increased lethality. The aim of this work was to characterize the cellular mechanisms, which lead to the accumulation of the mGBPs at the T. gondii PV membrane. Additionally the identification of protein motifs, which are important for the intracellular re-localization of the mGBPs after T. gondii infection, was of interest. Finally, the mGBP2-/- mice were characterized in a parasitic (T. gondii) as well as in a viral (MCMV) model. The accumulation of the mGBP2 at the parasitophorus vacuole (PV) of T. gondii was independent from the toll-like receptor (TLR) adaptor protein MyD88; this implicates a TLR-independent recruitment of the mGBPs to the PV. Also the host MAPK (mitogen activated protein kinase) and intracellular Ca2+-levels appear to have no effect on the mGBP recruitment. An important effector function for mGBP2 was seen in immune fluorescence staining experiments after selective permeabilization of infected cells. Only mGBP2-positive PVs were permeable for the T. gondii specific antibody. This was not seen in mGBP2-negative PVs or after infection with the virulent T. gondii strain BK, which is able to prevent mGBP recruitment at the PV. Live cell imaging videos showed that the mGBP2 vesicles are highly dynamic within the cell. Several fusion and fission processes could be observed, before and after T. gondii infection. The rapid accumulation of mGBP2 early after parasite entry could be observed, however a direct correlation with vesicle movement could not be established. mGBP2 appears to be released from the vesicles, followed by diffusion and accumulation around the PV. This notion was supported by experiments, in which the cytoskeleton dynamic was blocked by several inhibitors. After inhibition of the cytoskeleton dynamics, mGBP2 recruitment to the T. gondii PV was still detectable. First results indicate a role of the autophagy related protein ATG5. In ATG5-deficient fibroblasts less accumulation of mGBP2 around the T. gondii PV could be observed. However, inhibition of autophagy by several chemical inhibitors had no effect on mGBP2 recruitment. We suggest an Atg5-dependent but autophagy independent mechanism for the delivery of proteins with important effector functions like the mGBPs to the T. gondii PV. To identify protein motifs and amono acids, which are crucial for mGBP recruitment to the PV, a hybrid protein of mGBP6 and mGBP10 was cloned. These are highly interesting representatives of the mGBP family, because both proteins show very high sequence identity but differ in their recruitment capacity. With mutational analyses a single amino acid in the C-terminal part of the protein to be important for the recruitment to the PV could be determined (D542N). Furthermore, it could be shown that the recruitment of the mGBPs was dependent on T. gondii rhoptry proteins (ROP), since the ROP proteins of the virulent BK T. gondii strain prevent the accumulation of mGBPs. This was demonstrated by using a ROP-secretion-inhibitor, where mGBP accumulation detectable around the PV of virulent BK T. gondii. A new function of mGBP2 in the defense of viral infection could be described. After mCMV infection of mGBP2-/- mice a higher viral load was detected in several organs as compared to WT mice.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Medizinische Fakultät » Institute » Institut für Medizinische Mikrobiologie
Dokument erstellt am:	20.02.2014
Dateien geändert am:	20.02.2014
Promotionsantrag am:	14.10.2013
Datum der Promotion:	12.11.2013