Dokument: Wirkung des humanen Cytomegalovirus auf Transkription und Spleißregulation des MHC-kodierten Chaperons Tapasin
| Titel: | Wirkung des humanen Cytomegalovirus auf Transkription und Spleißregulation des MHC-kodierten Chaperons Tapasin | |||||||
| Weiterer Titel: | Impact of human cytomegalovirus on transcription and splicing of the MHC encoded chaperon tapasin | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=28394 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20150122-090132-0 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Diplom Biologe Hauka, Sebastian [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. med. Hengel, Hartmut [Gutachter] Prof. Dr. Wagner, Rolf [Gutachter] | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie | |||||||
| Beschreibungen: | In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss des humanen Cytomegalovirus (HCMV) auf die Transkription des MHC-kodierten Chaperons Tapasin untersucht, dessen Funktion essenziell im MHC Klasse I Antigenpräsentationsweg und damit für die effiziente CD8+ T Zell-vermittelte Immunantwort ist. In den durchgeführten Experimenten konnten zwei Mechanismen von HCMV gefunden und näher analysiert werden, die die Funktion von Tapasin betreffen: Die Inhibition der Tapasintranskription sowie die Generierung einer neuen, in dieser Arbeit beschriebenen Spleißvariante von Tapasin.
Im Rahmen von Vorarbeiten waren im Verlauf der HCMV-Infektion deutliche Unterschiede in der Zusammensetzung des, für den MHC Klasse I Antigenpräsentationsweg essenziellen, Peptidbeladungskomplexes (PLC) gefunden worden. Diese Unterschiede bestanden unabhängig von den bekannten HCMV-kodierten MHC I antagonisierenden Proteinen der Genregion US2-11 und wurden durch die hier vorgelegte Arbeit auf der Transkriptionsebene untersucht. So waren die Transkriptgesamtmengen und die Transkriptneusynthese der PLC Bestandteile Tapasin, TAP1 und TAP2 im Gegensatz zu den weiteren Bestandteilen HLA-B und β2m reduziert. Interessanterweise sank ausschließlich die Transkriptionsrate von Tapasin stark unterhalb jener, welche in nicht-infizierten Vergleichszellen gefunden wurde. Dies deutete auf eine selektive Regulation des Tapasingens hin. Zusätzlich konnte eine neue alternativ gespleißte Variante des Tapasintranskriptes, NeTT (neues Tapasintranskript, New Tapasin Transcript), während der Infektion beobachtet werden. Diese wurde im Gegensatz zum vollständigen Transkript während der HCMV Infektion verstärkt transkribiert. Dem NeTT-Protein fehlt infolge des Ausschlusses von Exon 3 Cystein 95, welches die für die Tapasinfunktion essenzielle Bindung an ERp57 vermittelt. Die Regulation, die zur Entstehung von NeTT führt, konnte mittels Mutationsanalysen in sogenannten Minigenen durch zwei Guanosin Wiederholungen (G runs) erklärt werden, ohne aber die starke Reduktion der Tapasintranskriptmenge während der Infektion erklären zu können. Es wurde kein Einfluss der HCMV-Infektion auf die Tapasin-mRNA-Stabilität gefunden. Quantitative PCR-Analysen neu-synthetisierter RNA deuteten dagegen auf eine direkte Regulation der Transkriptionsrate hin. In weiterführenden SEAP-Reportergen-Analysen (sezernierte alkalische Phosphatase) mit systematischen Promotor-Verkürzungsmutanten gelangen in Verbindung mit in silico Vorhersagen nicht nur neue Einblicke in den Aufbau des Tapasinpromotors, sondern auch die während der Infektion mutmaßlich negativ regulierte Promotorsequenz konnte auf 29 Nukleotide eingeengt werden. Es wurde gezeigt, dass die in dieser Sequenz vorhandene NF-κB-Bindestelle (nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells) nicht von der Infektion reguliert wird. Es wird vielmehr ein Modell vorgeschlagen, in dem eine inhibierte Mzf1-Bindung (myeloid zinc finger 1) zur reduzierten Promotoraktivität führt.Tapasin is a crucial factor of the MHC class I antigen presentation pathway presenting antigenic peptides to cytotoxic CD8+ T cells on the cell surface. The aim of this thesis was to gain understanding of human cytomegalovirus (HCMV) transcriptional regulation of the MHC-encoded chaperon tapasin. The experiments committed revealed two consequences of HCMV-infection on tapasin: i) inhibition of the tapasin promoter and ii) simultaneous appearance of a tapasin splice variant. Preceding infection studies of a ΔUS2-11 HCMV deletion mutant lacking the genes for established MHC I inhibitors, revealed changes in the constitution of the peptide loading complex (PLC), which is crucial for MHC class I quality control. In this study the reduction of tapasin protein in HCMV infection was found to be due to reduced transcript levels of tapasin. This was also found for TAP1 and TAP2, but not for HLA-B and β2m. However, only tapasin transcript biosynthesis declined to a level below transcription in mock-infected cells, pointing at a specific regulation of tapasin by HCMV. In addition, an alternatively spliced tapasin transcript lacking exon 3 (the new tapasin transcript, NeTT) was detected in infected cells. Interestingly, the reading frame of NeTT is not changed upon loss of exon 3 and, furthermore, exon 3 encodes for the cystein 95, which guarantees the crucial binding to ERp57 and is essential for tapasin function. This raised the question whether NeTT is able to counteract the function of tapasin. In contrast to tapasin transcript levels, NeTT was slightly induced upon infection. Splicing analysis of minigenes revealed that NeTT transcription can be controlled by G-runs located in the intronic sequence of the exon 3 splice donor, however, the G-runs are not responsible for the negative regulation of tapasin transcript levels. Tapasin mRNA stability was not changed in infection. In fact, PCR-analysis of nascent RNA pointed into the direction of inhibited transcription. Subsequent analysis of the tapasin promoter via promoter truncations in a genome-integrated SEAP (secreted alkaline phosphatase) reporter gene assay combined with in silico analysis gave insights into the constitution of the promoter. Moreover, the negatively regulated sequence could be narrowed down to 29 nucleotides, which included NF-κB (nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells) and Mzf1 (myeloid zinc finger 1) transcription factor binding sites. No indications for an NF-κB-binding-site regulation by HCMV could be found. Therefore, a model is proposed where the positive function of Mzf1 binding to the promoter is prevented in infection, leading to the strong down-regulation of tapasin transcriptional activity in HCMV-infected cells. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Medizinische Fakultät » Institute » Institut für Virologie | |||||||
| Dokument erstellt am: | 22.01.2015 | |||||||
| Dateien geändert am: | 22.01.2015 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 12.12.2013 | |||||||
| Datum der Promotion: | 29.01.2014 |
