Dokument: Tailor-made thiamine diphosphate-dependent enzymes for S-selective carboligation

Titel:	Tailor-made thiamine diphosphate-dependent enzymes for S-selective carboligation
Weiterer Titel:	Maßgeschneiderte Thiamindiphosphat-abhängige Enzyme zur S-selektiven Carboligation
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=28364
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20140213-104611-4
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Westphal, Robert [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 26,79 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 11.02.2014 / geändert 11.02.2014
Beitragende:	PD Dr. Pohl, Martina [Gutachter] Prof. Urlacher, Vlada [Gutachter] Prof. Dr. Faber, Kurt [Gutachter]
Stichwörter:	biocatalysis, thiamine diphosphate-dependent enzymes, carboligation, enzymatic asymmetric synthesis, hydroxy ketones
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Dokumententyp (erweitert):	Dissertation
Beschreibungen:	Thiamine diphosphate (ThDP)-dependent enzymes enable the challenging stereoselective synthesis of α-hydroxy ketones via asymmetric C–C bond formation. However, the steric and chemical properties of the enzymes’ active sites often limit the product range, specifically the access to (S)-α-hydroxy ketones. Introduction of the S-pocket concept, which explains stereoselectivity by the orientation of the substrates prior to carboligation, paved the way for the design of S-selective ThDP-dependent enzymes, however, often only with moderate stereoselectivity. This thesis aimed for new concepts to design tailor-made S-selective variants to expand the toolbox of ThDP-dependent enzymes. After confirmation of the general validity of the Spocket concept by transfer to the new toolbox enzymes acetohydroxyacid synthase and 2-succinyl-5-enolpyruvyl-6-hydroxy-3-cyclohexene-1-carboxylate synthase (MenD), two novel strategies were developed to tailor ThDP-dependent enzymes with high S-selectivity: (i) suppression of the “R-pathway”, and (ii) creation of “thiamine enzyme hybrids”. The combination of the basic S-pocket concept with targeted destabilization of the R-pathway improved the S-selectivity of pyruvate decarboxylase (PDC) as well as new MenD variants enabling carboligations with up to > 99 % ee. The design of a hybrid substrate-binding site from an S-selective PDC variant with a large S-pocket and a benzaldehyde lyase with a large donor binding site combined the different selectivity-determining modules and thus solved the long-standing problem of S-selective benzoin synthesis starting from readily available benzaldehydes. The results demonstrate the high quality of current structure-function relationships as well as the robustness of ThDP-dependent enzymes towards active site mutations. S-Selectivity can be adjusted now by different strategies. Moreover, the hybridization approach might pave the way for a tailor-made design of ThDP-dependent enzymes with desired and novel carboligation activities. This work complemented the toolbox of ThDP-dependent enzymes by four wild-type enzymes and about 35 variants with characterized carboligation activity, which broadened the enzymatically accessible α-hydroxy ketone platform by novel functionalized mixed araliphatic α-hydroxy ketones as well as (S)-benzoins with excellent ees. Thiamindiphosphat (ThDP)-abhängige Enzyme ermöglichen die anspruchsvolle stereoselektive Synthese von α-Hydroxyketonen durch asymmetrische C–C Knüpfungsreaktionen. Die sterischen und chemischen Eigenschaften der aktiven Zentren begrenzen jedoch häufig den Zugang zu den Produkten, speziell zu (S)-α-Hydroxyketonen. Die Einführung des S-Taschen Konzepts, das die Stereoselektivität durch die Anordnung der Substrate vor der Carboligation erklärt, ebnete den Weg für das Design S-selektiver ThDP-abhängiger Enzyme. Diese zeigen allerdings oftmals nur moderate Stereoselektivität. Die Doktorarbeit zielte auf die Entwicklung neuer Konzepte zum Design maßgeschneiderter S-selektiver Enzymvarianten zur Erweiterung der Toolbox ThDP-abhängiger Enzyme. Zunächst wurde die generelle Gültigkeit des S-Taschen Konzepts durch den Transfer auf die neuen Toolbox-Enzyme Acetohydroxysäuresynthase und 2-Succinyl-5-enolpyruvyl-6- hydroxy-3-cyclohexadien-1-carboxylat Synthase (MenD) bestätigt. Anschließend wurden zwei neue Strategien für das Design hoch S-selektiver ThDP-abhängiger Enzyme entwickelt: (i) Unterdrückung des „R-Wegs“ und (ii) Erzeugung von „Thiamin-Enzymhybriden“. Die Kombination des S-Taschen Konzepts mit der gezielten Destabilisierung des R-Wegs verbesserte die S-Selektivität der Pyruvatdecarboxylase (PDC) und neuer MenD Varianten, wodurch Carboligationen mit bis zu > 99 % ee ermöglicht wurden. Die Kombination unterschiedlicher Selektivität-bestimmender Module einer S-selektiven PDC und einer Benzaldehydlyase löste das seit langem bestehende Problem der S-selektiven Benzoinsynthese ausgehend von leicht verfügbaren Benzaldehyden. Die Ergebnisse belegen die hohe Qualität gegenwärtiger Struktur-Funktionsbeziehungen sowie die Robustheit ThDP-abhängiger Enzyme gegenüber Mutationen im aktiven Zentrum. S-Selektivität kann nun mithilfe verschiedener Strategien reguliert werden. Darüber hinaus könnte die Hybrid-Strategie den Weg zu maßgeschneiderten ThDP-abhängigen Enzymen mit neuen Carboligationsaktivitäten ebnen. In dieser Arbeit wurde die Toolbox ThDP-abhängiger Enzyme um vier Wildtyp-Enzyme und etwa 35 charakterisierten Enzymvarianten mit Carboligationsaktivität vergrößert, wodurch die enzymatisch zugängliche α-Hydroxyketon-Plattform um neue funktionalisierte α-Hydroxyketone sowie (S)-Benzoine mit exzellenten ees erweitert werden konnte.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät
Dokument erstellt am:	13.02.2014
Dateien geändert am:	13.02.2014
Promotionsantrag am:	05.03.2013
Datum der Promotion:	28.01.2014