Die Aminosäure L-Serin ist ein zentraler Metabolit im Stoffwechsel und von zunehmender Bedeutung für die industrielle Nutzung. Ziel der vorliegenden Arbeit war zu untersuchen, ob mit C. glutamicum L-Serin auch biotechnologisch gewonnen werden kann, und welchen Einfluss hierbei der L-Serin-Abbau und die Vorstufenbereitstellung über die Glykolyse haben.

Zur Verbesserung der Vorstufenbereitstellung für die L-Serin-Biosynthese wurden eine Pyruvatkinase- und eine 3-Phosphoglyceratmutase-Mutante hergestellt. Es konnte gezeigt werden, dass die Pyruvatkinase essentiell für das Wachstum auf dem nicht-PTS (Phosphotransferase-System)-Zucker Ribose sowie auf den glukoneogenetischen Substraten Acetat und Citrat ist. Globale Genexpressionsanalysen und Enzymtests mit einer Suppressormutante ergaben, dass das Wachstum der Pyruvatkinase-Mutante auf Acetat und Citrat durch Überexpression des mez-Gens, welches für das Malat-Enzym kodiert, wieder hergestellt werden kann. Weiterhin zeigte sich, dass die Pyruvatkinase-Mutante glykolytische Vorstufen für die L-Serin-Biosynthese akkumuliert.

Um die 3-Phosphoglyceratmutase auszuschalten, wurde zunächst das funktionell exprimierte Gen im C. glutamicum-Genom anhand von Sequenzvergleichen und Wachstumsexperimenten identifiziert. Durch Deletion dieses Gens konnte eine Mutante erzeugt werden, die nur in Anwesenheit eines glykolytischen und eines glukoneogenetischen Substrats wachsen kann. Dabei wurde der nicht-PTS-Zucker Maltose besser verstoffwechselt als Glucose, die über ein PTS-System aufgenommen wird. Es zeigte sich, dass die Mutante 23 mal mehr des unphosphorylierten L-Serin-Vorläufers Glycerat akkumuliert als der Wildtyp.

Um den Abbau von L-Serin zu untersuchen, wurde zunächst das für die L-Serindehydratase kodierende Gen im Genom von C. glutamicum anhand von Sequenzvergleichen identifiziert. Die anschließende Deletion bzw. Überexpression des sdaA-Gens ergab, dass die Deletionsmutante im Vergleich zum Wildtyp L-Serin mit 1,8-fach geringerer Rate, der Überexpressionsstamm jedoch mit einer 2-fach verstärkten Rate abbaut. Interessanter Weise führte die sdaA-Überexpression dazu, dass C. glutamicum auf L-Serin als einziger C-Quelle wachsen kann.

Die Deletion des sdaA-Gens in einem Stamm, der zusätzlich die L-Serin-Biosynthesegene überexprimiert, führte zu einer 960-fachen Steigerung der L-Serin-Akkumulation auf 2,9 mM. Wurden gleichzeitig auch die Enzyme 3-Phosphoglyceratmutase oder Pyruvatkinase deletiert, konnte eine weitere Steigerung der L-Serin-Bildung auf 4,7 bzw. 8 mM erreicht werden. Weiter stellte sich heraus, dass die Deletion von sdaA und die gleichzeitige Reduktion der Aktivität der Serinhydroxymethyltransferase, einem weiteren L-Serin umsetzenden Enzym, in einem Stamm der die L-Serin-Biosynthesegene überexprimiert, zu einem drastischen Anstieg der L-Serin-Akkumulation auf 100 mM führte.

The amino acid L-serine is a central metabolite in the metabolism and of increasing importance for the industrial use. The aim of this work was to investigate if L-serine can be produced biotechnologically by Corynebacterium glutamicum and to study the influence of L-serine degradation and the provision of glycolytic precursors.

To improve the availability of glycolytic precursors for the L-serine biosynthesis, a pyruvate kinase and 3-phosphoglycerate mutase deletion mutant was constructed. It could be shown that pyruvate kinase is essential for growth both on the non PTS (phosphotransferase system) sugar ribose and on the gluconeogenetic substrates acetate and citrate. Global gene expression analyses and enzyme assays with a suppressor mutant showed, that the growth of the pyruvate kinase mutant on acetate and citrate could be restored by overexpression of the mez gene encoding the malic enzyme. Further it was shown, that the pyruvate kinase mutant accumulates glycolytic precursors for L-serine biosynthesis.

To inactivate the 3-phosphoglycerate mutase, the functional expressed gene was identified by sequence analysis and growth experiments. A pgm deletion mutant was only able to grow in presence of both a glycolytic and a gluconeogenetic substrate. Thereby, the non-PTS sugar maltose has been metabolised preferentially to glucose that is taken up via a PTS system. It has been shown that the mutant accumulates the unphosphorylated L-serine precursor glycerate.

To investigate the L-serine degradation the L-serine dehydratase encoding gene was identified in the C. glutamicum genome by sequence comparison. The subsequent deletion of the sdaA gene resulted in a 1.8-fold decreased L-serine degradation rate in comparison to the wild type but the overexpression of sdaA led to a 2-fold increased degradation rate. Interestingly, the overexpression of sdaA enabled C. glutamicum to grow on L-serine.

The deletion of the sdaA gene in a C. glutamicum strain overexpressing the L-serine biosynthesis genes revealed a 960-fold gain of the L-serine accumulation. After an additional deletion of either the 3-phosphoglycerate mutase or pyruvate kinase encoding gene, a further increase of the L-serine formation was found. Further it was shown that the deletion of sdaA and the simultaneous reduction of the serine hydroxymethyltransferase activity, another L-serine converting enzyme, in a strain overexpressing the L-serine biosynthesis genes, led to a tremendous increase of L serine accumulation up to 100 mM.