Dokument: Bakterielle LOV-Blaulichtrezeptoren und deren Verwendung als Fluoreszenzreporter und Photosensibilisatoren
| Titel: | Bakterielle LOV-Blaulichtrezeptoren und deren Verwendung als Fluoreszenzreporter und Photosensibilisatoren | |||||||
| Weiterer Titel: | Bacterial LOV blue-light receptors and their application as fluorescent reporter proteins and photosensitizers | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=28310 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20140211-102342-0 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Dipl. Biol. Endres, Stephan [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Jaeger, Karl-Erich [Gutachter] Prof. Dr. Groth, Georg [Gutachter] | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie | |||||||
| Beschreibungen: | Blaulichtrezeptoren, die auf light, oxygen, voltage (LOV) Sensordomänen basieren, sind in Mikroorganismen, Pilzen und Pflanzen weit verbreitet. In dieser Arbeit sind LOV-Proteine in Hinblick auf ihre Photorezeptoreigenschaften und regulatorische Funktionen untersucht worden. Weiterhin wurde ihre Anwendbarkeit in der Biotechnologie und Biomedizin näher untersucht.
Im ersten Teil der Arbeit wurde ein „short LOV“ Protein aus dem marinen Bakterium Dinoroseobacter shibae identifiziert und photochemisch charakterisiert, das neben der Lichtrezeptordomäne keine weitere regulatorische Effektordomänen aufweist. Nach der heterologen Expression und Reinigung des als DsLOV bezeichneten Photorezeptors wurde mittels spektroskopischer Methoden nachgewiesen, dass der Blaulichtrezeptor Flavinmononukleotid (FMN) als Blaulicht-absorbierendes Chromophor trägt und nach Lichtanregung (max. 450 nm) ein Photoaddukt ausbildet, welches für LOV-Proteine eine ungewöhnlich kurze Lebensdauer von 9,6 Sekunden besitzt. Im Rahmen eines Kooperationsprojektes wurde anschließend die Röntgenstruktur des neuen LOV-Proteins aufgeklärt. Durch Sequenz-, Struktur- und Mutationsanalysen konnte der Aminosäurerest M49 identifiziert werden, der maßgeblich an dem schnellen Photozyklus beteiligt ist. Im zweiten Teil wurde untersucht, welche regulatorische Funktion der Blaulichtrezeptor DsLOV in D. shibae besitzt. Dazu wurde mittels homologer Rekombination eine DsLOV-defiziente D. shibae Mutante erzeugt und ihr Wachstumsverhalten unter verschiedenen Belichtungsbedingungen mit dem des Wildtypstamms verglichen. Anhand dieser Studien konnte beobachtet werden, dass das phototrophe Bakterium D. shibae die Photopigmente Spheroidenon und Bakteriochlorophyll a nur dann ausbildet, wenn kein Blaulicht auf die Zellen trifft. Überraschender Weise zeigte die dslov Mutante, unabhängig von der Lichtfarbe, keine Akkumulation der Photopigmente. Somit konnte erstmals gezeigt werden, dass der neue Photorezeptor DsLOV an der Blaulicht-vermittelten Inhibierung der Photopigmentsynthese beteiligt ist. Neben der Analyse Licht-vermittelter DsLOV-abhängiger Prozesse wurde im dritten Teil der Arbeit untersucht, in wieweit verschiedene LOV-Varianten (i) als Fluoreszenzproteine und (ii) als genetisch kodierte Photosensibilisatoren eingesetzt werden können. Bei den Varianten handelt es sich um bakterielle und pflanzliche LOV-Derivate, die keinen Photozyklus durchlaufen und dadurch nach ihrer Anregung Licht in Form von blaugrüner Fluoreszenz (max. 495 nm) emittieren. Um zu analysieren, ob mit der Fluoreszenz auch eine Licht-induzierte Sauerstoffradikalproduktion einhergeht, wurde die Radikalproduktion bei sechs ausgewählten LOV-basierten Fluoreszenzproteinen (LOV-FP) in quantitativen in vitro Studien nachgewiesen. Mittels in vivo Phototoxizitätsstudien, die mit E. coli Zellen und muriner HT22 Tumorzellen durchgeführt wurden, konnte abschließend gezeigt werden, dass die Sauerstoffradikalproduktion der LOV-FPs zum einen für die Induktion einer spezifischen Stressantwort in Bakterien und zum anderen zur gezielten Abtötung von Bakterien und Maus-Tumorzellen eingesetzt werden kann.Blue-light receptors based on light oxygen voltage (LOV) sensor domains are widespread among microorganisms, fungi and plants. Within this thesis, LOV proteins have been examined with respect to their characteristics as photoreceptors and their regulatory functions. Additionally, their applicability for biotechnology and biomedicine has been investigated. In the first part of this thesis, a short-LOV protein from marine Dinorosebacter shibae featuring no regulatory effector domains except its light receptor domain was identified and subsequently characterized photochemically. This so called DsLOV photoreceptor has been expressed heterologically, isolated and purified. The spectroscopic analysis revealed flavin mononucleotide (FMN) being the blue light absorbing chromophore of DsLOV. Excited with blue light (max 450 nm), a photo-adduct is formed, showing a remarkably short live time of only 9.6 seconds. Within a collaboration project, the three-dimensional structure of the new blue-light receptor DsLOV was solved by X-ray crystallography. By means of sequence, structure and mutational analysis amino acid residue M49 was identified as being essential for the fast photocycle. Within the second part of this thesis, regulatory functions of the blue-light receptor DsLOV were studied in vivo. A DsLOV-deficient mutant strain of D. shibae was constructed by homologous recombination. Its growth behavior was investigated under different light-conditions in comparison to the respective wild-type strain. These studies revealed that the phototrophic bacterium D. shibae accumulates its photo-pigments spheroidenone and bacteriochlorophyll a only in the absence of blue-light. Surprisingly, the dslov— mutant does not accumulate any photo-pigments irrespective of the light source. Thus, it was shown for the first time that the photo-receptor DsLOV is involved in the inhibition of light-mediated photo-pigment synthesis of D. shibae. Furthermore, the applicability of different variants of LOV fluorescent-proteins (LOV-fp) as (i) reporter proteins and (ii) genetically encoded photosensitizers has been investigated within the third part of this thesis. All variants are bacterial or plant-based LOV-derivatives that do not undergo a photo-cycle. Therefore, these proteins emit fluorescence light in the blue-green range (max 495 nm) of the light spectrum after excitation with light of appropriate wavelengths. Quantitative in vitro studies of six different LOV-fp revealed that fluorescence light emission is accompanied by light-induced production of reactive oxygen species (ROS). Furthermore, in vivo photo-toxicity studies in E. coli and murine HT22 tumor-cells proved that the LOV-fp-generated ROS can be employed for the induction of specific bacterial stress responses as well as for targeted killing of bacteria and mouse tumor-cells. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Enzymtechnologie | |||||||
| Dokument erstellt am: | 11.02.2014 | |||||||
| Dateien geändert am: | 11.02.2014 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 25.09.2013 | |||||||
| Datum der Promotion: | 15.11.2013 |
