Dokument: Das BTB-Protein Psg1 als Suppressor von O-Glykosylierungsdefekten in Candida albicans

Titel:	Das BTB-Protein Psg1 als Suppressor von O-Glykosylierungsdefekten in Candida albicans
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=28287
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20140206-113318-7
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Ullmann, Steffen [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 12,56 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 05.02.2014 / geändert 05.02.2014
Beitragender:	Prof. Dr. Ernst, Joachim F. [Betreuer/Doktorvater]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	O-Mannosylierung durch die fünf Isoformen der Protein-O-Mannosyltransferasen (Pmt) beeinflusst die Oberflächeneigenschaften und Virulenz des humanpathogenen Pilzes Candida albicans. In früheren Arbeiten waren die Proteine Dom34 und Yil001w als potenzielle Faktoren der O-Mannosylierung in S. cerevisiae identifiziert wurden. In dieser Arbeit wurde das zu YIL001w-homologe Gen ORF19.7010 aus C. albicans, hier bezeichnet als PSG1, charakterisiert. PSG1 ist eines von insgesamt zwei Genen in C. albicans, deren Sequenzen BTB-Domänen aufweisen und daher potenzielle Substratadaptoren von Cul3-basierten Ubiquitinligase-Komplexen darstellen. In C. albicans wurden zwei unabhängige psg1-Deletionsmutanten konstruiert und auf ihre Phänotypen hin untersucht. Die Deletion des PSG1-Gens führte zur Ausbildung verschiedener Phänotypen, wie gestörtes Hyphenwachstum auf Festmedien und Sensitivität gegenüber Inhibitoren einschließlich Tunicamycin, Clotrimazol, Caspofungin und dem Pmt1-Inhibitor. Außerdem war eine homozygote psg1-Mutante vollständig avirulent im Mausmodell einer systemischen C. albicans-Infektion. Die Disruption des PSG1-Gens blockierte jedoch nicht generell die N- und O-Glykosylierung von sekretorischen Proteinen in C. albicans. In einer genomweiten Transkriptanalyse der psg1-Mutante in C. albicans wurden insgesamt 248 regulierte Gene identifiziert, wobei der Transkriptspiegel von 94 Genen erhöht und von 154 Genen erniedrigt war. Die Funktion und Regulation dieser Gene deuten darauf hin, dass in der psg1-Mutante ein erhöhter oxidativer Stress sowie eine veränderte Zellwand-Komposition vorliegen. Ferner scheint die Ergosterol-Biosynthese beeinträchtigt zu sein, da die Transkriptspiegel der Gene ERG10, ARE2, ERG11, ERG9, ERG5, ERG3 und NCP1 in der psg1-Mutante im Vergleich zum Wildtypstamm signifikant erniedrigt waren. Durch Überexpression des PSG1-Gens wurden Defektphänotypen einer pmt1-Mutante (erhöhte Zell-Aggregation, Sensitivität gegenüber Hygromycin B) und einer pmt4-Mutante (Sensitivität gegenüber Hygromycin B) aufgehoben. Mit einer pmt1 dom34-Doppelmutante konnte gezeigt werden, dass für diese Suppression die Anwesenheit des Dom34-Proteins erforderlich ist. Diese Ergebnisse zeigen daher eine genetische Interaktion zwischen den Genen PSG1, PMT1 und DOM34; ferner liegt eine genetische Interaktion zwischen PSG1 und PMT4 vor. Durch die Markierung des Psg1-Proteins mit einem C-terminalen Hämagglutinin-Epitop wurde die Lokalisation des Psg1-Proteins im perinukleären und im Cytoplasmamembran-nahen kortikalen Bereich des endoplasmatischen Retikulums nachgewiesen. Weiterhin konnten mit Hilfe des Hefe-Zwei-Hybrid Systems die Genprodukte der GCD2-, TIP120- und ORF19.2366-Gene als Interaktionspartner von Psg1 identifiziert werden. Tip120 ist in C. albicans an der Regulation des SCF-Komplexes beteiligt, was die Hypothese über die Funktion von Psg1 als Substratadaptor von Ubiquitin-Ligasen unterstützt. Homologe Proteine von Gcd2 in Hefe fungieren als Delta-Untereinheit des Translations-Initiationsfaktors elF2B, wodurch Psg1 auch einen Einfluss auf die Translation haben könnte. Durch die erhaltenen Ergebnisse kann angenommen werden, dass Psg1 als Substratadaptor einer Ubiquitin-Ligase fungiert und durch Ubiquitinierung die O-Glykosylierung indirekt reguliert. In einem Modell zur Funktion von Psg1 werden potentielle Zielproteine am ER und im Cytoplasma diskutiert. O-mannosylation by the five isoforms of protein-O-mannosyltransferases (Pmt) has an influence on surface properties and virulence of the human fungal pathogen Candida albicans. In previous work the proteins Dom34 and Yil001w were identified as potential factors for O-mannosylation in S. cerevisiae. In this work the YIL001w-homologue in C. albicans, ORF19.7010, here referred to as PSG1, was characterized. PSG1 is one of two genes in C. albicans, whose sequences contain BTB-domains and therefore may represent potential substrate-adaptors of Cul3-based ubiquitin-ligase complexes. In C. albicans two independent psg1-deletion mutants were constructed and examined for their phenotypes. The deletion of the PSG1 gene resulted in the formation of various phenotypes, such as impaired hyphal growth on solid media, sensitivity against inhibitors including tunicamycin, clotrimazole, caspofungin and the Pmt1-inhibitor. Furthermore, a homozygous psg1-mutant showed a complete loss of virulence in the mouse model of systemic C. albicans infection. However, disruption of the PSG1-gene had no general effect on N- and O-glycosylation of secreted proteins in C. albicans. Using a genome-wide transcript analysis of the psg1-mutant 248 regulated genes were identified, of which 94 genes showed an increased and 154 showed a decreased transcript level. Function and regulation of these genes suggest an increased oxidative stress, as well as an altered cell wall composition in the psg1-mutant. The psg1-mutant also appears to be defective in ergosterol biosynthesis because transcript levels of the genes ERG10, ARE2, ERG11, ERG9, ERG5, ERG3 and NCP1 were significantly lowered, as compared to the wild-type strain. Defective phenotypes of a pmt1 mutant (formation of cell aggregates, hygromycin B- sensitivity) as well as a pmt4-mutant (hygromycin B-sensitivity) were abolished by overexpression of the PSG1-gene. Using a pmt1 dom34 double mutant it was shown that the presence of the Dom34 protein is critical for suppression. These results indicate a genetic interaction between the genes PSG1, PMT1 and DOM34; furthermore, genetic interaction occurs between PSG1 and PMT4. By C-terminal labeling with a hemagglutinin epitope the Psg1 protein was localized in the perinuclear and in the cytoplasm-near cortical area of the endoplasmic reticulum. By use of the yeast two-hybrid system the gene products of the genes GCD2, TIP120 and ORF19.2366 could be identified as interactors of Psg1. Tip120 in C. albicans is involved in the regulation of the SCF-complex, which supports the hypothesis that Psg1 may function as a substrate-adaptor in ubiquitin-ligase complexes. Yeast homologues of Gcd2 act as the delta subunit of the translation initiation factor elF2B indicated that Psg1 could be involved in translation. The results suggest that Psg1 acts as a substrate adaptor of an ubiquitin-ligase and thereby influences of O-glycosylation indirectly by ubiquitination. A model for the function of Psg1 is discussed, in which potential Psg1 target proteins reside at the ER and in the cytoplasm.
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Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Mikrobiologie
Dokument erstellt am:	06.02.2014
Dateien geändert am:	06.02.2014
Promotionsantrag am:	27.01.2014
Datum der Promotion:	04.02.2014