Dokument: Regulation der mitochondrialen Transkription durch mitochondriale Topoisomerase I

Titel:	Regulation der mitochondrialen Transkription durch mitochondriale Topoisomerase I
Weiterer Titel:	Mitochondrial transcription regulation by mitochondrial Topoisomerase I
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=28277
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20140205-114446-8
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Sobek, Stefan [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 16,00 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 04.02.2014 / geändert 04.02.2014
Beitragende:	Prof. Dr. med. Boege, Fritz [Gutachter] Prof. Dr. Martin, William [Gutachter]
Stichwörter:	mitochondrial Transcription, mitochondrial Topoisomerase I
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 540 Chemie
Beschreibungen:	Die humane mitochondriale DNA (mtDNA) ist ein doppelsträngiges, ringförmiges Molekül. Transkription und Replikation führen zu topologischem Stress, der beseitigt werden muss um einen korrekten Ablauf der Prozesse zu gewährleisten. Dazu dient unter anderem eine nukleär kodierte mitochondriale Typ IB Topoisomerase (TOP1MT), die mtDNA-Überspiralisierung entfernen kann. TOP1MT ist für Transkription und Replikation inessentiell. Dennoch zeigen TOP1MT-/- Zellen mitochondriale Dysfunktionen und eine mito-biogene Stressantwort im Zellkern. In der vorliegenden Arbeit wurde die unklare Rolle von TOP1MT im mitochondrialen DNA-Stoffwechsel untersucht. Es stellte sich heraus, dass TOP1MT als dominant negativer Regulator der mitochondrialen Transkription fungiert: TOP1MT-Defizienz stimuliert und TOP1MT-Überschuss hemmt die Expression mitochondrialer Gene. Durch die Hemmung werden die Atmungsketten Komplexe I, III, IV abgereichert, die Zellatmung gedrosselt und Superoxid-Konzentration sowie Laktatausstoß gesteigert. Dieser negative Einfluss auf die Transkription setzt katalytische Aktivität voraus und steht in auffälligem Gegensatz zur Situation im Zellkern, wo aktive Topoisomerase I die Transkription stimuliert. Im Gegensatz zur chronischen TOP1MT-Defizienz induziert ein akuter Mangel im Kern weder eine mito-biogene Stressantwort noch eine kompensatorische Hochregulation der Topoisomerase IIB. Somit ist ein lokaler intra-mitochondrialer Effekt als Ursache der erhöhten mtDNA-Expression wahrscheinlicher als ein im Zellkern induzierter Mechanismus. Durch Koimmunprezipitation konnte eine physische Interaktion zwischen TOP1MT und der mitochondrialen RNA Polymerase (POLRMT) nachgewiesen werden. Innerhalb der Mitochondrien war TOP1MT hochmobil und akkumulierte an aktiv transkribierten Nukleoiden, was durch Kolokalisation mit POLRMT und naszierender RNA gezeigt werden konnte. Eine katalytisch inaktive Mutante verhielt sich vergleichbar, zeigte jedoch keinen Einfluss auf die mitochondriale Transkription. TOP1MT konnte durch oxidiertes Glutathion inhibiert und durch thiolreduktive Substanzen wie DTT stimuliert werden, was auf eine Modulation der Aktivität durch den intra-mitochondrialen Redox Zustand hinweist. Passend dazu wurde die TOP1MT Aktivität in situ durch eine Antimycin A Behandlung der Mitochondrien gehemmt. Die gewonnen Ergebnisse deuten auf einen bis dato unbekannten TOP1MT vermittelten Regulations-Mechanismus der mitochondrialen Transkription, der durch den Redox Status innerhalb der Mitochondrien gesteuert wird. Human mitochondrial DNA (mtDNA) is a closed, double-stranded DNA circle. Strand separation during transcription/replication creates topological stress that interferes with mtDNA metabolism if not released by Topoisomerases. Mitochondrial Topoisomerase I (TOP1MT) is a nuclear–encoded enzyme, resolving supercoils in mtDNA. TOP1MT-/- cells exhibit mitochondrial dysfunction and a nuclear mito-biogenic stress response, although TOP1MT is inessential for mtDNA transcription or replication. Thus, its role in mitochondrial function - while clearly relevant - remains unclear. The aim of this work was to investigate the role of TOP1MT in mtDNA metabolism. We discovered that TOP1MT acts as direct negative regulator of mtDNA-transcription, a function depending on enzymatic activity. Deficiency or depletion of TOP1MT increased mitochondrial transcripts, whereas overexpression lowered mitochondrial transcripts, depleted respiratory chain complexes I, III and IV, decreased cell respiration and raised superoxide levels. Negative impact on transcription required DNA relaxation activity, which is in striking contrast to the stimulatory effect of Topoisomerase I activity on nuclear rRNA and mRNA transcription. In contrast to constitutive deficiency, acute siRNA-mediated depletion of TOP1MT did not trigger a nuclear mito-biogenic stress response and (compensatory) up-regulation of Topoisomerase II, suggesting that the concomitant increase in mitochondrial transcripts was due to the release of a local effect. TOP1MT was co-immunoprecipitated with mitochondrial RNA polymerase. It selectively accumulated and rapidly exchanged at a subset of nucleoids distinguished by newly synthesized RNA and/or the presence of mitochondrial RNA polymerase. A catalytically inactive TOP1MT variant behaved similarly without affecting mitochondrial transcript abundance. TOP1MT was inactivated by oxidized glutathione and stimulated by thiol-reductive compounds (DTT), suggesting its activity is controlled by the intra-mitochondrial redox state via conserved cysteines in the enzyme core. Indeed, increased mitochondrial ROS levels induced in situ by antimycin A inactivated TOP1MT. These observations support the model of a double negative loop, by which TOP1MT directly regulates mtDNA-transcription in a redox-sensitive fashion.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät
Dokument erstellt am:	05.02.2014
Dateien geändert am:	05.02.2014
Promotionsantrag am:	16.12.2013
Datum der Promotion:	23.01.2014