Dokument: Expression, Reinigung und Charakterisierung von posttranslational modifiziertem zellulärem Prion Protein aus Pichia pastoris

Titel:	Expression, Reinigung und Charakterisierung von posttranslational modifiziertem zellulärem Prion Protein aus Pichia pastoris
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=28179
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20140127-132622-9
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Marbach, Jendrik [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 5,26 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 23.01.2014 / geändert 23.01.2014
Beitragende:	Prof. Dr. Heise, Henrike [Gutachter] Prof. Dr. Willbold, Dieter [Gutachter]
Stichwörter:	Prion, PrP
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Prionkrankheiten sind fatale neurodegenerative Erkrankungen in Mensch und Tier, welche eine spontane, genetische oder infektiöse Ätiologie aufweisen können. Die Erreger der Prionkrankheiten sind Prionen, deren Hauptbestandteil die krankheitsassoziierte Isoform des Prion Proteins (PrPSc) darstellt. Das Prion Protein ist ein wirtseigenes, posttranslational modifiziertes Membranprotein, das ebenfalls im gesunden Organismus exprimiert wird (PrPC). Dabei ist das Prion Protein über einen Glykosylphosphatidylinositol-Anker (GPI-Anker) in der Zellmembran inkorporiert. Es wird angenommen, dass die Konversion von PrPC in die fehlgefaltete Isoform PrPSc an oder in der Nähe der Zellmembran stattfindet und die Integration des Prion Proteins in der Zellmembran durch den GPI-Anker entscheidend ist. Aus diesem Grund sind Strukturdaten von membranassoziiertem PrPC von großer Bedeutung. Die meisten bisher durchgeführten Experimente und gewonnenen Strukturdaten basieren auf löslichem, rekombinantem PrP (recPrP), welches in E. coli exprimiert wurde. Auf Grund der Expression in E. coli wird recPrP nicht posttranslational modifiziert und weist weder Glykosylierungen noch die Modifikation mittels GPI-Anker auf. Ziel dieser Arbeit war es, die Expression sowie die Reinigung von vollständig modifiziertem Prion Protein in dem eukaryotischen Pichia pastoris-System zu etablieren. Darauffolgend sollte das exprimierte PrPC auf seine posttranslationalen Modifikationen hin analysiert und erste strukturelle Daten von PrPC in Membranumgebung gewonnen werden. Im Zuge der Arbeit konnte gezeigt werden, dass PrPC in verschiedenen, glykosylierten Isoformen erfolgreich in P. pastoris exprimiert und prozessiert wird. Das exprimierte PrPC ist durch den GPI-Anker in der Zellmembran lokalisiert. Dies konnte durch einen Vergleich mit dem löslichen Modellprotein GFP, mit und ohne PrPC-spezifische Signalsequenzen, bestätigt werden. Des Weiteren wurde die Reinigung des PrPCs etabliert, wodurch erstmals vollständig modifiziertes PrPC für NMR-Strukturanalysen in ausreichend großen Mengen bereitgestellt werden konnte. Das exprimierte und gereinigte PrPC weist eine für zelluläres PrPC bekannte, großteils α-helikale Struktur auf. Neben der Expression und Reinigung des PrPC konnte die GPI-Anker-vermittelte Interaktion von PrPC mit raft-like Liposomen durch Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation gezeigt werden. Schließlich wurden erste Festkörper-NMR-Spektren von membrangebundenem PrPC aufgenommen, wobei für einige spezifisch zugeordnete Aminosäuren erste Aussagen zu deren lokalen Sekundärstrukturmerkmalen getroffen werden konnten. Prion diseases are fatal neurodegenerative diseases with infectious, spontaneous or genetic etiology. The main component of prions is the disease-associated isoform of the prion protein (PrPSc). The prion protein is a host encoded cellular membrane protein (PrPC) that is glycosylated and attached to the cell membrane via a glycosylphosphatidylinositol-anchor (GPI-anchor). It is likely, that conversion of non-infectious PrPC into infectious PrPSc occurs in close proximity to the outer cell membrane. Furthermore it was shown that attachment to the cell membrane via a GPI-anchor is crucial for the conversion process. For elucidating the mechanism it is highly important to obtain structural data of membrane-attached PrPC. Up to now many studies on PrP, including the NMR-solved structure of PrP, were determined utilizing recombinant PrP (recPrP), which is expressed in E. coli. recPrP is not posttranslationally modified and lacks both glycosylation and GPI-anchor, respectively. The aim of this study was the expression and purification of fully posttranslationally modified PrPC in the eukaryotic expression system Pichia pastoris. Moreover posttranslational modifications should be analyzed and first structural data of membrane attached PrPC should be obtained. In this work, expression and posttranslational processing of Syrian golden Hamster PrPC including its native N- and C-terminal signal sequences in the yeast P. pastoris was established. The GPI-anchor mediated membrane localization was shown and confirmed by the analysis of green fluorescent protein as a model protein with and without PrP-specific signal sequences respectively. PrPC glycosylation could be verified using PNGaseF. Moreover a purification protocol for PrPC was developed providing sufficient amounts of fully modified PrPC for NMR-measurements. The purified, soluble PrPC showed a typical α-helical secondary structure. Furthermore the GPI-anchor modification was proven by interaction studies of PrPC with raft-like liposomes utilizing sucrose gradient centrifugation. In addition solid-state NMR-measurements of membrane bound PrPC were conducted and first secondary structure information of some few specific assigned amino acids were obtained.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Physikalische Biologie
Dokument erstellt am:	27.01.2014
Dateien geändert am:	27.01.2014
Promotionsantrag am:	25.11.2013
Datum der Promotion:	17.12.2013