Dokument: Interdomain Functional Dynamics of Phosphoglycerate Kinase Studied by Single-Molecule FRET

Titel:	Interdomain Functional Dynamics of Phosphoglycerate Kinase Studied by Single-Molecule FRET
Weiterer Titel:	Studie über die funktionelle Dynamik der wechselwirkenden Domänen bei Phosphoglyceratkinase mittels Einzelmolekül-FRET
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=28145
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20140325-130904-0
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Gabba, Matteo [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 2,41 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 21.03.2014 / geändert 21.03.2014
Stichwörter:	Biophysics / Protein Dynamics, Fluorescence Spectroscopy, Single-Molecule FRET
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	The protocols to perform reliable and reproducible single-molecule FRET (smFRET) experiments with a confocal microscope on diffusing molecules were established. This method was applied to investigate the interdomain functional dynamics of phosphoglycerate kinase (PGK) from yeast. In fact, this enzyme catalyzes an important step of the glycolytic pathway, where a reversible phosphor transfer reaction takes place between two substrates bound to the two different domains of PGK. Therefore, smFRET experiments were performed on freely diffusing PGK labeled on the two structural subunits, in order to characterize the timescale of the fluctuations and the distribution of states of the domains. Furthermore, the redistribution of the conformational substates upon ligand binding was investigated. Finally, an elastic network model of the protein was simulated under the random Multiparticle Collision Dynamics approach, including the dye linkers contribution with an accessible volume algorithm. The model excellently describes the smFRET experiments. Moreover, the functional relevance of the interdomain motions and their geometry were identified. The results highlight the intrinsically dynamic and flexible nature of PGK, with dynamics spanning from nanoseconds to milliseconds. A partially closed and compact conformation of the domains was disclosed. Large amplitude Brownian fluctuations start from this partially closed state in the direction towards the catalytically competent conformation. These functionally relevant fluctuations are faster than milliseconds, most likely on the nanoseconds timescale, and are encoded in the structural topology of PGK. A set of open and extended conformations of the domains was also observed. These conformers are static on the milliseconds timescales, and their functional relevance is still not known. The open and the partially closed states interconvert on the milliseconds timescale. Ligand binding reshapes the states distribution populating the partially closed state which better allows to reach the catalytically competent conformation. In addition, a conformational rearrangement within the closed state increases the inter-dye distance by means of a propelled twist like motion. These results have an impact on the present view on the PGK catalytic behavior, complementing and supporting previous works. In fact, the geometry of the interdomain motions, together with the possible functional relevance of these motions, is assessed. Furthermore, the results of this thesis support the conformational selection model of substrate binding, and the emerging paradigm which states that ’structure-encodes-dynamics’ and ’dynamics-encodes-function’. In fact, the ligands favour the conformation of the domains most suitable for function, which is the closed one, and the functional motions of PGK are encoded in the 3D structure of the ligand-free protein. Ziel dieser Arbeit war es, mittels konfokaler Fluoreszenz Mikroskopie verlässliche und reproduzierbare Einzelmolekül-FRET Untersuchungen an frei diffundierenden Molekülen zu etablieren und anzuwenden, um funktionell relevante Bewegungen der beiden Domänen der Phosphoglyceratkinase (PGK)aus der Hefe Saccharomyces cerevisiae zu untersuchen. Dieses Enzym katalysiert einen entscheidenden Schritt der Glykolyse, nämlich den reversiblen Phosphattransfer zwischen den zwei Substraten der PGK, die jeweils an eine der beiden Domänen binden. Um den Zeitrahmen der Fluktuationen und die Verteilung der Zustände der PGK-Domänen zu charakterisieren, wurden Einzelmolekül-FRET Experimente an frei diffundierenden Molekülen durchgeführt. Dazu wurde das Protein an beiden strukturellen Untereinheiten fluoreszenzmarkiert. Zusätzlich wurde die Neuverteilung der Konformationen während der Ligandenbindung untersucht. Mit Hilfe des random Multiparticle Collision Dynamics Ansatz wurde schließlich ein elastisches Netzwerkmodell des Proteins simuliert, das einen accessible volume-Algorithmus zur Berechnung des Farbstoff-Linker-Beitrags enthält. Das Modell beschreibt die Einzelmoleküluntersuchungen äußerst genau und dient darüber hinaus dazu, die funktionelle Relevanz der Domänenbewegungen und deren Geometrie aufzuklären. Die Daten spiegeln die flexible Struktur der PGK und ihre intrinsische Dynamik auf einer Zeitskala von Nano- bis Millisekunden wider. Sie zeigen eine partiell geschlossene und kompakte Konformation der Domänen. BROWN’sche Bewegungen großer Amplitude sind von diesem partiell geschlossenen Zustand bishin zur katalytisch aktiven Konformation zu beobachten. Diese funktionell relevanten Fluktuationen sind schneller als Millisekunden, sehr wahrscheinlich im Nanosekundenbereich, und liegen in der strukturellen Topologie der PGK begründet. Verschiedene offene und ausgedehnte Konformationen der Domänen konnten ebenfalls beobachtet werden. Diese Konformere sind für Millisekunden stabil, jedoch ist ihre funktionelle Relevanz bisher unbekannt. Die Änderung der Konformation vom offenen zum partiell geschlossenen Zustand und andersherum findet in wenigen Millisekunden statt. Ligandenbindung verschiebt die Verteilung der Konformationen in Richtung des partiell geschlossenen Zustands, der die Bildung der katalytisch aktiven Konformation begünstigt. Zusätzlich wird die Distanz zwischen beiden Farbstoffen durch eine propeller-ähnliche Drehbewegung während der Konformationsänderung innerhalb des geschlossenen Zustands der PGK erhöht. Die Ergebnisse dieser Arbeit ergänzen und unterstützen frühere Erkenntnisse über das katalytische Verhalten der PGK. Die Geometrie der Domänenbewegungen und deren funktionelle Relevanz konnten gezeigt werden. Außerdem bekräftigen die Ergebnisse dieser Arbeit das Konformations-Selektions-Modell der Substratbindung und das aufkommende Paradigma, welches besagt, dass Struktur Dynamik und Dynamik Funktion kodiert. Und tatsächlich bevorzugen die Liganden die Konformation, die am ehesten funktionell ist und die funktionellen Bewegungen der PGK Domänen sind in der 3D Struktur des liganden-freien Proteins kodiert.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Physikalische Biologie
Dokument erstellt am:	25.03.2014
Dateien geändert am:	25.03.2014
Datum der Promotion:	17.12.2013