Dokument: Determination of the AIDA-I ß-barrel crystal structure: getting the clue to the autotransporter secretion pathway

Titel:	Determination of the AIDA-I ß-barrel crystal structure: getting the clue to the autotransporter secretion pathway
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=28081
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20140114-112135-5
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Gawarzewski, Iris [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 19,51 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 13.01.2014 / geändert 13.01.2014
Beitragende:	Prof. Dr. Schmitt, Lutz [Gutachter] Prof. Dr. Jose, Joachim [Gutachter]
Stichwörter:	Autotransporter, AIDA-I, Type V Secretion
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Im Laufe der Evolution entwickelten sich in Gram-negativen Bakterien Sekretionssysteme, um Proteinen, die an Prozessen wie bakterieller Kommunikation, Nährstoffaufnahme, Detoxifikation und Pathogenität beteiligt sind, zu exportieren. Darunter wird das Typ V Sekretionssystem (T5SS) vornehmlich von pathogenen Bakterien verwendet, um Adhäsine, Enzyme, Toxine und andere Virulenzfaktoren zu sekretieren. Dabei ist der genaue Transportmechanismus bis heute nicht bekannt. Die Zielsetzung dieser Arbeit bestand in der röntgenkristallographischen Strukturaufklärung der Transporteinheit des adhesin involved in diffuse adherence (AIDA-I) aus enteropathogenen Escherichia coli, das zur Gruppe der monomeren Autotransporter innerhalb der T5SS gezählt wird. Die Transporteinheit von AIDA-I, die im Rahmen dieser Arbeit mit AIDA-I-linker-β2 bezeichnet wird, wurde mit einem Signalpeptid für den Transport über die cytoplasmatische Membran, einem His6-Tag und einem Antigen-Tag zur Immunodetektion und Reinigung fusioniert. Der His6-Tag wurde einmal hinter dem Signalpeptid, welches nach Transport über die cytoplasmatische Membran abgespalten wird, und einmal hinter der β2-Domäne am C-Terminus eingesetzt. Die resultierenden Fusionsproteine wurden mit FP-HisN163 und FP-HisC163 gekennzeichnet. Die induzierte Expression resultierte in der Bildung zweier unterschiedlich prozessierten Formen von FP-HisN163 und FP-HisC163. Die schwächer exprimierten Formen ließen aufgrund von Entfaltungsstudien darauf schließen, dass diese vollständig prozessiert und korrekt gefaltet waren. Die überwiegend gebildeten Formen der rekombinanten Autotransporter hingegen wiesen das N-terminale Signalpeptid noch auf. Dieses sollte während des Transportprozesses über die cytoplasmatische Membran durch die Signalpeptidase abgespalten werden und so eine korrekte Faltung der Autotransporterproteine ermöglichen. Um die Bildung der vollständig prozessierten und korrekt gefalteten Formen von FP-HisN163 und FP-HisC163 zu verstärken, wurden verschiedene Expressionsbedingungen und Escherichia coli-Expressionsstämme getestet. Dabei erwies sich keine der gewählten Bedingungen als geeignet. Durch konstitutive Expression konnten ausreichende Mengen an prozessiertem und korrekt gefaltetem FP-HisN163 zu Reinigungs- und Kristallisationszwecken produziert werden. In einer Reihe unterschiedlicher Kristallisationsbedingungen konnten Kristalle gewonnen und röntgendiffraktometrisch vermessen werden. Der Datensatz eines Kristalls wurde schließlich verwendet, um die Struktur der Transporteinheit AIDA-I-linker-β2 mit 3.0 Å Auflösung zu lösen. AIDA-I-linker-β2 weist ein β-Fass auf, das aus 12 β-Strängen besteht. Diese sind über kurze periplasmatische und längere extrazelluläre Bereiche miteinander verbunden. Die Linkerdomäne durchzieht die Pore des β-Fass, wobei nur der N-Terminus eine α-helikale Konformation annimmt und der C-Terminus unstrukturiert bleibt. Die Transporteinheit von AIDA-I weist eine hohe strukturelle Übereinstimmung mit anderen monomeren Autotransportern auf, was auf einen gemeinsamen Sekretionsmechanismus hindeutet. During evolution, secretion mechanisms were developed in Gram-negative bacteria to export a huge variety of proteins, which are involved bacterial communication, nutrient uptake, detoxification and pathogenicity. Among them, the type V secretion system (T5SS) is widely used by pathogenic bacteria to export adhesins, enzymes, toxins and other virulence factors but the detailed transport process is not completely known until now. The topic of this thesis was the determination of the X-ray crystal structure of the transport unit of adhesin involved in diffuse adherence (AIDA-I) from enteropathogenic Escherichia coli, which belongs to the group of monomeric autotransporter within the T5SS. The transport unit of AIDA-I, termed AIDA-I-linker-β2, was fused to an N-terminal signal peptide for the transport across the inner membrane, which is subsequently cleaved off, a his6-tag and a peptide antigen tag for immunodetection and purification. According to the position of the his6-tag at the N- or C-terminus, these recombinant autotransporter were termed FP-HisN163 and FP-HisC163. The induced expression resulted in the production of two different forms of FP-HisN163 and FP-HisC163. The weakly expressed forms represented the correctly cleaved and properly folded autotransporter, which was confirmed by heat modification studies. The highly expressed forms still contained the N-terminal signal peptide. This signal peptide should have been removed by the signal peptidase during the Sec-dependent transport across the inner membrane allowing the correct folding of the autotransporter. Different expression conditions under the control of an inducible promotor and different kinds of Escherichia coli strains were tested to promote the expression of the correctly folded forms of FP-HisN163 and FP-HisC163. None of the tested condition was suitable for this purpose. Finally, by constitutive expression, the amount of correctly processed and folded FP-HisN163 was suitable for purification and crystallization trials. Several crystallization conditions resulted in crystals that were analysed by X-ray diffraction. A data set of one crystal was used to solve the structure of the transport unit AIDA-I-linker-β2 at 3.0 Å resolution. AIDA-I-linker-β2 contains a β-barrel, which is composed of 12 β-strands connected by short periplasmic turns and long extracellular loops. The linker domain is accommodated in the hydrophilic pore, whereas the N-terminal part adopts an α-helical fold and the C-terminal part remains unstructured. The transport unit of AIDA-I shares a high structural similarity to other monomeric autotransporter indicating a common secretion mechanism.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Chemie » Biochemie
Dokument erstellt am:	14.01.2014
Dateien geändert am:	14.01.2014
Promotionsantrag am:	19.11.2013
Datum der Promotion:	13.12.2013