Dokument: Heterologe Produktion von aminosäurebasierten bakteriellen Tensiden

Titel:	Heterologe Produktion von aminosäurebasierten bakteriellen Tensiden
Weiterer Titel:	Heterologous production of amino acid derived bacterial surfactants
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=28019
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20150312-100750-9
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Thies, Stephan [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 18,05 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 06.01.2014 / geändert 06.01.2014
Beitragende:	Prof. Dr. Jaeger, Karl-Erich [Gutachter] Prof. Dr. Feldbrügge, Michael [Gutachter]
Stichwörter:	Biotenside, biosurfactants, heterologe Expression, Metagenom, Lipopeptide
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Dokumententyp (erweitert):	Dissertation
Beschreibungen:	Tenside sind von immenser Bedeutung für Industrie-, Pharma- und alltägliche Haushaltsanwendungen. Bis heute werden die meisten Tenside auf Basis von Erdöl hergestellt. In Folge des Nachhaltigkeitsgedanken gibt es aber ein steigendes Interesse an auf nachwachsenden Rohstoffen basierenden oberflächenaktiven Substanzen. Zu diesen gehören die mikrobiell, z.B. von Organismen der Gattungen Starmerella, Ustilago, Bacillus oder Pseudomonas, produzierten Biotenside, die sich durch gute biologische Abbaubarkeit, geringe Toxizität und ihre strukturelle Mannigfaltigkeit auszeichnen. Diese Eigenschaften führen zu einer Vielzahl von potentiellen Anwendungsmöglichkeiten für Vertreter dieser Klasse von Sekundärmetaboliten. Daher ist es sinnvoll, weitere Biotenside für biotechnologische Prozesse zu entdecken und durch geeignete Produktionsstrategien zu erschließen, um das für bekannte und neue Anwendungen verfügbare Portfolio zu erweitern. In dieser Arbeit konnte erstmalig die Produktion von Serrawettin W1 auch für Serratia marcescens DSM12481, das eine neue Variante der Serrawettinsynthetase SwrW besitzt, gezeigt werden. Serrawettin W1 ist ein rotationssymmetrisches Cyclodepsipeptid aus zwei Serin- und zwei β-Hydroxyfettsäureresten mit hoch interessanten Eigenschaften, für das aber bisher kaum Studien bezüglich der Bereitstellung für die Biotechnologie durchgeführt wurden. Hier konnten im isolierten Biotensid durch HPLC-MS bislang unbekannte Kongenere des Lipopeptids mit längeren Fettsäuren identifiziert werden. Aufgrund der Humanpathogenität des homologen Wirtes S. marcescens und der komplexen Regulation der Biotensidproduktion in diesem Stamm wurden hier auch alternative Produktionssysteme evaluiert, um diese möglichen Hindernisse für biotechnologischen Einsatz zu umgehen. Erstmals konnte in dieser Arbeit die Produktion von Serrawettin W1 erfolgreich in den heterologen Wirten Erwinia billingiae, Escherichia coli und Pseudomonas putida etabliert werden. Dabei erwies sich die Expression nur eines einzelnen Gens (swrW) aus S. marcescens DSM12481 als ausreichend zur erfolgreichen heterologen Produktion. Weitere Arbeiten ergaben, dass entscheidende Voraussetzungen für die funktionelle Expression der nichtribosomalen Peptidsynthetase SwrW in allen Expressionssystemen eine Transkriptionskontrolle durch einen schwächeren Promotor und eine Kultivierung bei 30°C waren. Es fiel auf, dass sich die Serrawettin W1-Kongenerzusammensetzung der Isolate aus den verschiedenen Produktionswirten geringfügig unterschieden und so eine weitere Diversifizierung der Biotensid-Palette erreichbar ist. Zudem wurde hier erstmalig gezeigt, dass E. billingiae auch selbst oberflächenaktive Substanzen produziert. Alternativ wurde erstmals ein Metagenomscreening als Strategie zur Detektion gänzlich unbekannter Biotenside durchgeführt. Neben der Herstellung und Etablierung geeigneter molekularer Werkzeuge und Assay-Methoden konnten in dieser Arbeit erstmals Biotensid produzierende Klone in einer Metagenombibliothek detektiert werden. Bei zwei Klonen konnte die Produktion von N-Acyltyrosin, hauptsächlich N-Myristoyltyrosin, nachgewiesen werden. Dieser Sekundärmetabolit, der bisher nur für seine antibakteriellen Eigenschaften beschrieben wurde, zeigte nach Analyse der chemo-physikalischen Eigenschaften im Rahmen dieser Arbeit eindeutig Tensidcharakteristika. Auch die heterologe Synthese dieser Biotenside konnte hier aufgeklärt werden und ist katalysiert durch zwei neue Mitglieder der N-Acylaminosäuresynthase-Familie, klassifiziert durch Strukturhomologien. Neben den Tensideigenschaften weist N-Acyltyrosin wachstumshemmende Eigenschaften bei einem breiten Spektrum von Bakterien auf und besitzt somit relevante Charakteristika, auch in Bezug auf eine mögliche biotechnologische Anwendung. Im Rahmen dieser Arbeit wurden neue Biotenside identifiziert, der sinnvolle Einsatz von Metagenomdurchmusterung zur Detektion neuer Biotenside nachgewiesen und die heterologe Produktion von Biotensiden durch Expression einfacher Synthesewege entwickelt. Die Grundlagen für eine biotechnologische Nutzung von N-Acyltyrosin und Serrawettin W1 wurden gelegt, so dass das bisher Glycolipid-dominierte Spektrum von Biotensiden in der Anwendung erweitert werden kann. Molecules with surface active properties are of immense importance for industrial, pharmaceutical and everyday household applications. To date, most surfactants are produced from petroleum feedstock. During the last years, there has been a growing interest in surfactants based on renewable raw materials following the concept of sustainability. Among these are the biosurfactants, surfactants of microbial origin that feature good biological degradability, low toxicity and structural diversity These properties lead to various potential applications for compounds from this class of secondary metabolites. Therefore, it is worthwhile to discover and exploit further biosurfactants for biotechnological processes in order to extent the portfolio for biotechnological applications. In this work, the production of serrawettin W1 was shown for the first time for the strain Serratia marcescens DSM12481, which contained a novel variant of the serrawettin synthetase SwrW. Serrawettin W1 is a rotationally symmetric cyclodepsipeptide consisting of two serine molecules and two β-hydroxy fatty acids that shows highly interesting properties and is still nearly unexplored regarding the production for biotechnological purposes. Within this work, previously unpublished congeners of this lipopeptide with longer fatty acids were identified in the isolated biosurfactant by HPLC-MS. Due to the pathogenicity of the homologous production host S. marcescens and the complex regulation of biosurfactant production in this organism, alternative production systems were evaluated in order to circumvent these potential drawbacks. For the first time, the production of serrawettin W1 was successfully established in the heterologous host organisms Erwinia billingiae, Escherichia coli and Pseudomonas putida. The heterologous expression of a single gene from S. marcescens DSM12481, swrW, was shown to be sufficient for serrawettin W1 production. Further studies indicated transcriptional control by a rather weak promoter as well as a cultivation temperature of 30°C as prerequisites for the functional expression of the nonribosomal peptide synthetase SwrW in all expression systems. It occurred that the congener compositions of serrawettin W1, which was isolated from the different production hosts, were slightly dissimilar. Moreover, E. billingiae was identified as a previously unknown biosurfactant producing strain; according to in silico analyzes, it should be able to produce a serrawettin-like peptide itself. In addition, metagenome screening was evaluated as a strategy for the detection of novel biosurfactants. Besides the establishment of suitable molecular biological tools and assays, biosurfactant producing clones could be detected in a metagenomic library for the first time. Two clones from a library that contained DNA originating in a slaughterhouse sink biofilm were identified as producers of N-acyltyrosine, mostly N-myristoyltyrosine. This secondary metabolite, which has been described previously only for its antibacterial properties, showed definitely surfactant characteristics after chemo-physical analysis. Furthermore, the heterologous synthesis of these biosurfactants was elucidated; it is catalyzed by two novel members of the N-acyl amino acid synthase family, classified by structural homologies. Beyond surfactant properties, N-acyltyrosine showed growth-inhibiting properties towards a wide range of bacteria and thus has relevant characteristics in respect to possible biotechnological applications. Within the scope of this work, novel biosurfactants were identified, the utility of metagenomic library screening for the detection of new biosurfactants was demonstrated and strategies for heterologous production of biosurfactant were developed. Hence, both N-Acyltyrosin and serrawettin W1 are now accessible for variety of interesting biotechnological applications.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Enzymtechnologie
Dokument erstellt am:	12.03.2015
Dateien geändert am:	12.03.2015
Promotionsantrag am:	02.09.2013
Datum der Promotion:	24.10.2013