Bei der industriellen Subtilisin-Gewinnung erfolgt die Expression des Subtilisin-Gens von einem Plasmid, welches zur anfänglichen Selektion eine Antibiotikaresistenzkassette enthält. Die eigentliche Fermentation wird jedoch ohne Antibiotika im Medium durchgeführt, so dass ein Teil der Zellen das Plasmid während der Kultivierung verliert. In dieser Arbeit wurde ein alternatives Selektionssystem konstruiert, bei dem das essentielle secA-Gen als Selektionsmarker fungiert. Das Selektionssystem ist funktionell und im Schüttelkolben-Maßstab wurden Subtilisin-Ausbeuten in mindestens der gleichen Größenordnung erzielt wie mit dem Ausgangsstamm ohne Selektionsdruck durch Antibiotika. Die vollständige Stabilität des konstruierten Subtilisin-SecA-Plasmids lässt erwarten, dass insbesondere unter den fermentativen Bedingungen der industriellen Subtilisin-Gewinnung eine signifikante Ausbeutesteigerung erzielt werden kann.

For the industrial production of subtilisin, the subtilisin gene is expressed from a high copy plasmid, which harbors an antibiotic resistance cassette for the initial selection. In contrast, the real fermentation is carried out without adding antibiotics, therefore some of the cells from the culture will lose their plasmid. In the present work, an alternative selection system was constructed with the secA gene as a selection marker. The constructed subtilisin-SecA-plasmid was stable in the secA deletion strain throughout the entire cultivation period. In shaking flask experiments this strain secrets amounts of subtilisin into the supernatant at least similar to those obtained with the original strain without selection pressure by antibiotics. The perfect stability of the subtilisin-SecA-plasmid indicates that especially under the fermentative conditions of industrial subtilisin production a significant increase in yield can be reached.