Dokument: Proteininteraktion der Proteinkinase AKT 1

Titel:	Proteininteraktion der Proteinkinase AKT 1
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=27999
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20140107-115522-0
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Hiester, Andreas [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 3,46 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 06.01.2014 / geändert 06.01.2014
Beitragende:	Prof. Dr. Gödecke, Axel [Gutachter] Univ.-Prof. Dr. Sebastian Wesselborg [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften » 610 Medizin und Gesundheit
Beschreibung:	Hintergrund: Die Proteinkinase AKT 1 spielt eine zentrale Rolle bei einer Vielzahl zellulärer Prozesse, wie Zellwachstum, Proliferation, Apoptose und Metabolismus. AKT 1 wurde erstmals 1991 beschrieben, und man kennt inzwischen zwei weitere Isoformen, die als AKT 2 und AKT 3 bezeichnet werden. Die drei Isoformen werden von drei verschiedenen Genen codiert und besitzen auf Sequenzebene eine 80- prozentige Homologie. Häufig werden in derselben Zelle mehrere der Isoformen exprimiert und prinzipiell über dieselben Signalwege aktiviert. Trotz Koexpression und Sequenzhomologie zeigen selektive Knockout (KO) Mäuse der drei Isoformen stark unterschiedliche phänotypische Ausbildungen. So fallen AKT 1 KO Mäuse durch erhöhte Apoptoserate und geringe Körpergröße auf, AKT 2 KO Mäuse präsentieren Glucoseverwertungsstörungen, und AKT 3 KO Mäuse zeigen ein beeinträchtigtes Gehirnwachstum. Die Mechanismen der Isoformspezifität sind für die AKT Kinasen nur ansatzweise verstanden. Fragestellung: Spezifische Funktionen der AKT Isoformen setzen spezifische Interaktionen mit anderen Proteinen voraus, die sich in der Organisation von AKTassoziierten Proteinkomplexen äußern könnten. Im Rahmen dieser Arbeit wurde daher untersucht, ob sich mittels Tandem-Affinitätsreinigung (TAP) gefolgt von massenspektrometrischer Analyse (MS Analyse) spezifische Bindungspartner von AKT 1 isolieren und identifizieren lassen, die einen Einblick in die AKT 1 vermittelte Signaltransduktion und somit ihre spezifischen Funktionen geben können. Methodik: Zur Tandemaffinitätsreinigung wurde die cDNA von AKT 1 sowohl am C-terminalen als auch N-terminalen Ende mit einem 8 kDa großen Tag fusioniert, welches die Sequenzen für das HA-, FLAG- und Strep-Tag enthielt. Die Fusionsproteine wurden in HEK293T Zellen exprimiert und über zwei Affinitätsreinigungsschritte (anti-FLAG-Agarose; Streptactin Sepharose) gereinigt. Um die mit AKT 1 assozierten Proteinkomplexe nicht zu zerstören, erfolgte die Elution vom Säulenmaterial jeweils unter nativen Bedingungen. Nach erfolgreicher TAP folgte die gelektrophoretische Trennung, Silberfärbung des Gels und anschließende Isolierung der Proteinbanden aus dem Gel. Diese wurden einer tryptischen Verdauung unterworfen und zur Identifizierung massenspektrometrisch analysiert. Die isolierten Proteine wurden durch Datenbankabgleich der erhaltenen Peptidsequenzen identifiziert. Ergebnisse: Die TAP wurde sowohl für AKT 1 C-Tag als auch AKT 1 N-Tag transfizierte Zellen wiederholt durchgeführt. Interessanterweise ließen sich für nur für AKT 1 N-Tag assoziierte Proteine in den Gelen und der MS Analyse nachweisen, jedoch nicht bei entsprechender Verwendung von AKT 1 C-Tag. Analyse der mit AKT 1 N-Tag assoziierten Proteine führte zur Identifizierung bereits bekannter AKTInteraktionspartner (HSP90, GRP78, HSP70, CDC37). Allerdings wurden hier erstmalig Tubulin α1 und β1, Phosphorylase B Kinase und CAD Protein als neue Interaktionspartner von AKT 1 nachgewiesen. Schlussfolgerung: Die Funktion der erstmalig identifizierten AKT 1 Interaktionspartner lässt darauf schließen, dass AKT 1 neue regulatorische Funktionen bei der Modulation des Metabolismus (Phosphorylase Kinase), sowie der Zellteilung (Tubuline, CAD Protein) ausübt.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Medizinische Fakultät » Institute » Institut für Herz- und Kreislaufphysiologie
Dokument erstellt am:	07.01.2014
Dateien geändert am:	07.01.2014
Promotionsantrag am:	04.10.2012
Datum der Promotion:	17.12.2013