Dokument: Rhodobacter capsulatus als Wirtsstamm zum aktivitätsbasierten Screening von Enzymen und zur Synthese von Membranproteinen
| Titel: | Rhodobacter capsulatus als Wirtsstamm zum aktivitätsbasierten Screening von Enzymen und zur Synthese von Membranproteinen | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=27946 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20131219-125956-3 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Dr. Malach, Anuschka [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Jaeger, Karl-Erich [Gutachter] Prof. Dr. Groth, Georg [Gutachter] | |||||||
| Stichwörter: | Rhodobacter, Lipasen, Esterasen, Lichtregulation, Membranproteine | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie | |||||||
| Beschreibungen: | Die Identifizierung neuer Gene und deren funktionelle Synthese steht in der Biotechnologie und Medizin aufgrund verschiedenster Anwendungsmöglichkeiten im besonderen Fokus. Die funktionelle Expression wirtsfremder Gene in gut handhabbaren Mikroorganismen ermöglicht hierbei die einfache und kostengünstige Produktion beliebiger Zielproteine. Die erfolgreiche Genexpression im Standardexpressionswirt Escherichia coli wird jedoch häufig durch verschiedene Faktoren wie Proteintoxizität oder die Bildung unlöslicher Proteinaggregate limitiert. Eine Möglichkeit diese Limitierungen zu umgehen, ist die Verwendung alternativer Expressionswirte. Im Rahmen dieser Arbeit wurde das fakultativ phototrophe -Proteobakterium Rhodobacter capsulatus als Expressionswirt für funktionsbasierte Screenings von Genen aus dem Metagenom sowie für die Synthese von heterologen Membranproteinen eingesetzt und mit den Wirten E. coli und Pseudomonas putida verglichen. Mittels komparativer Expressions- und Aktivitätsstudien konnte gezeigt werden, dass die Verwendung mehrerer bakterieller Expressionswirte mit unterschiedlichen physiologischen Eigenschaften eine funktionsbasierte Durchmusterung von Genbanken deutlich verbessern kann. So zeigten beispielsweise drei der sechs untersuchten lipolytischen Enzyme, die aus verschiedenen Metagenombanken stammten, in dem photosynthetischen Bakterium die höchsten Enzymaktivitäten. Im zweiten Teil der Arbeit wurde R. capsulatus als Expressionswirt für die Synthese heterologe Membranproteine evaluiert. Im Gegensatz zu herkömmlichen Expressionswirten bildet R. capsulatus unter phototrophen Wachstumsbedingungen ein weit verzweigtes intracytoplasmatisches Membransystem aus. Anhand von Expressionsanalysen unter chemoheterotrophen und phototrophen Wachstumsbedingungen konnte nachgewiesen werden, dass die einzigartige Membranmorphologie für die Akkumulation der heterologen Membranproteine CYP175A1, Squalenepoxidase und Bakteriorhodopsin essentiell ist. Mit Hilfe einer Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation konnte zudem der Nachweis erbracht werden, dass die heterologen Membranproteine in die Vesikel des intracytoplasmatischen Membransystems eingelagert wurden. Im Fall der P450-Monooxygenase CYP175A1 konnte darüber hinaus anhand eines CO-Differenzspektrums die korrekte Faltung und Kofaktorbeladung des Proteins nachgewiesen werden. Somit ist R. capsulatus ein vielversprechender alternativer Expressionswirt, der nicht nur die funktionelle Synthese schwer exprimierbarer Membranproteine ermöglicht, sondern überdies semiartifizielle Membranvesikel für zukünftige nanobiotechnologische Anwendungen bereitstellt. Im letzten Teil der Doktorarbeit erfolgte die Charakterisierung des nif-Promotor-basierten R. capsulatus-Expressionsvektors pRhonHi-2. In R. capsulatus kontrolliert dieser Promotor die Expression der Nitrogenase-Strukturgene. Unter Verwendung zweier Zielgene, die für das yellow fluorescent protein (YFP) bzw. Bakteriorhodopsin kodieren, konnte eine starke Pnif-vermittelte Überexpression sowie eine strikte Repression in Gegenwart von Ammonium nachgewiesen werden. Die Verwendung verschiedener Lichtquellen führte darüber hinaus zu einer unerwarteten Beobachtung: Die Pnif-vermittelte Expression unterlag zusätzlich einer blaulichtabhängigen Repression. Somit kann der nif-Promotor-basierte Expressionsvektor in R. capsulatus als leistungsstarkes optogenetisches System zur lichtgesteuerten Kontrolle der heterologen Genexpression eingesetzt werden.The identification and synthesis of new genes is important in biotechnology and medicine due to the wide variety of possible applications in these areas. The functional expression of heterologous genes in easily manageable microorganisms enables a simple and cost-efficient way to produce any target gene. However, successful gene expression in the most common expression host Escherichia coli is often limited due to several factors such as protein toxicity or the synthesis of insoluble protein aggregates. A possibility to overcome this limitation is the utilisation of alternative expression hosts. Within the presented work, the facultative phototrophic α-proteobacteria Rhodobacter capsulatus was used as an expression host for function-based screening of genes from the metagenome as well as the synthesis of membrane proteins and was compared to E. coli and Pseudomonas putida. Comparative expression and activity studies have shown that the utilisation of several bacterial expression hosts with different physiological properties can optimise the function-based screenings of gene libraries. In this case, three of the six investigated lipolytic enzymes from various metagenomic libraries showed the highest enzyme activity in the phototropic bacterium. Furthermore, R. capsulatus was evaluated as an expression host for the synthesis of heterologous membrane proteins. In contrast to common expression hosts, R. capsulatus exhibits a strongly enlarged intra-cytoplasmic membrane system when cultivated under phototropic growth conditions. Expression analysis with chemoheterotrophic and phototropic growth conditions proved that the unique membrane morphology is essential for the accumulation of the membrane proteins CYP175A1, Squalene epoxidase and Bacteriorhodopsin. Also, sucrose density gradient centrifugation has shown that the heterologous membrane proteins were integrated in vesicles of the intracytoplasmatic membrane system. In the case of the P450 Monooxygenase CYP175A1, a CO-differentiation spectrum also confirmed correct folding and cofactor loading. Therefore, R. capsulatus shows to be a promising alternative expression host, which not only allows the functional synthesis of membrane proteins that are difficult to express, but also provides semi-artificial membrane vesicles for future application in nanobiotechnology. In addition, the nif-promoter based R. capsulatus expression vector pRhonHi 2 was characterized. This promoter controls the expression of nitrogenase structural genes in R. capsulatus. With the usage of two different target genes, which encodes the yellow fluorescent protein (YFP) and bacteriorhodopsin, a strong Pnif-controlled over-expression and a strict repression in the presence of ammonium was established. The application of different light sources presented an unexpected observation. The Pnif-controlled expression also underlies blue-light regulated repression. Therefore, the nif-promoter-based expression vector can be used as a high-performance optogenetic system for the light regulated heterologous gene expression in R. capsulatus. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Enzymtechnologie | |||||||
| Dokument erstellt am: | 19.12.2013 | |||||||
| Dateien geändert am: | 19.12.2013 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 13.09.2013 | |||||||
| Datum der Promotion: | 30.10.2013 |
