Dokument: Toward intracellular membrane Transport- Characterization of the Mitochondrial Carrier Family in Plants

Titel:	Toward intracellular membrane Transport- Characterization of the Mitochondrial Carrier Family in Plants
Weiterer Titel:	Intrazellulärer Membrantransport- Charakterisierung der Familie mitochondrialer Carrier (MCF) in Pflanzen
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=27944
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20131218-153548-0
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Keßel-Vigelius, Sarah [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 73,27 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 18.12.2013 / geändert 18.12.2013
Beitragende:	Prof. Dr. Weber, Andreas P. M. [Gutachter] Prof. Dr. Feldbrügge, Michael [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Pathways of plant metabolism are interconnected, which necessitates a broad repertoire of transport proteins, enabling the flux of energy, metabolic precursors, or end products across compartments (Lunn, 2007). A large family of metabolite transporters in plants is the mitochondrial carrier family (MCF) (Picault et al., 2004). MCF carriers are present in various organelles of the plant cell, including mitochondria, plastids, and peroxisomes (Haferkamp, 2007). They exhibit different substrate specificities, exchanging adenine nucleotides, amino acids, dicarboxylic acids, cofactors, phosphate and other metabolites across membranes. In Arabidopsis 58 MCF carriers are known, but only a quarter of them are characterized (Palmieri et al., 2011). Mitochondrial carrier family proteins share a common threefold repetitive structure of 96 amino acids and a characteristic sequence motif, called mitochondrial energy signature (Picault et al., 2004). This repetitive sequence was used to simultaneously screen 20 plant proteomes for uncharacterized MCF carriers. Identified carriers were grouped into orthologous clusters according to their biochemical transport functions (Manuscript 1). In this screen we unexpectedly observed that the PHT3 family of mitochondrial phosphate transporters was split into two orthologous groups, although previous studies regarded the MCF carriers as one family of homologs (Picault et al., 2004). One orthologous group comprised PHT3;1 and PHT3;2, whereas the second group contained PHT3;3 (At2g17270). Since PHT3;3 was separated from the other PHT3 proteins, we hypothesized that this carriers displays a different function. Grouping exclusively with land plants and not with any algal, fungal or animal species, we hypothesized that PHT3;3 might have a function specific for plants. The biochemical characterization of this carrier revealed a role of PHT3;3 in mitochondrial sulfate import (Manuscript 2). Hence, the carrier was termed inorganic sulfate transporter 1 (SIT1). Analyses of sit1 T-DNA mutants revealed impairments in plant growth and development. Hence, an involvement of SIT1 in plant energy metabolism was hypothesized. We proposed that SIT1 and mitochondrial dicarboxylate carriers (DIC) might act in concert, shuttling dicarboxylic acids in exchange for sulfate. When SIT1 is absent, DIC carriers might import dicarboxylic acids and export phosphate instead of sulfate. Increased phosphate export could in turn cause decreased levels of mitochondrial ATP synthesis. Such an energy deprivation might lead to growth defects throughout all developmental stages as observed in sit1 plants. However, the putative interplay of SIT1 and DIC carriers needs to be investigated in the future. Regulation of cellular pH and establishment of proton gradients across membranes is crucial for plant metabolism and solute transport (Gjetting et al., 2012). We assessed the peroxisomal pH in different tissues, expressing a pH-sensitive green fluorescent protein in Arabidopsis peroxisomes. Measurements of the pH in these organelles revealed an acidic pH in etiolated shoot peroxisomes, whereas the matrix of root peroxisomes was alkaline (Manuscript 3). The results implied a functional differentiation of peroxisomes in roots and in etiolated hypocotyl cells (Hayashi and Nishimura, 2003). In Arabidopsis, peroxisomes of hypocotyls are mainly involved in fatty acid β-oxidation. To elucidate if the cause for a peroxisomal acidification is linked to peroxisomal metabolism in this tissue, we examined the pH of hypocotyl peroxisomes in an Arabidopsis mutant deficient ATP import. Peroxisomal ATP supply is essential for fatty acid degradation and is mediated by the peroxisomal adenine nucleotide carriers 1 and 2 (PNC1, PNC2) (Linka et al., 2008). We hypothesized that either ATP import into peroxisomes is proton-compensated acidifying the peroxisomal lumen, or that β-oxidation and glyoxylate cycle influence the peroxisomal pH, as these metabolic processes release acids. Experiments demonstrated that the peroxisomal pH is not affected by β-oxidation and glyoxylate cycle, as lumenal pH of hypocotyl peroxisomes was not altered in mutants lacking PNC1 and PNC2. Additional studies were conducted to elucidate if peroxisomal proton pumps exist, which might control peroxisomal pH homeostasis and cause an acidification of the peroxisomal lumen (Addendum, VII.1). Preliminary experiments revealed that in the presence of the specific P-type ATPase inhibitor ortho-vanadate (Dröse and Altendorf, 1997), the acidic peroxisomal pH of hypocotyls almost reached wild-type level (pH 7.2). Further experiments are necessary to clearly determine if P-type ATPases regulate the pH of peroxisomes. This thesis contributed to expand the knowledge of mitochondrial carrier family proteins in peroxisomes and mitochondria of plants, (i) developing a method to simultaneously identify MCF carriers in multiple plant proteomes, (ii) characterizing the mitochondrial sulfate transporter SIT1, (iii) analyzing the impact of the MCF members PNC1 and PNC2 involved in β-oxidation on peroxisomal pH, and (iv) elucidating the putative role of ATPases in peroxisomal pH maintenance. Die Stoffwechselwege des pflanzlichen Metabolismus sind eng miteinander verbunden und über verschiedene Zellkompartimente verteilt. Dies erfordert ein großes Repertoire an Transportproteinen, die über Kompartimentgrenzen den Fluss von Energie, metabolischen Vorstufen, oder Endprodukten ermöglichen (Lunn, 2007). Eine bedeutende Familie pflanzlicher Transportproteine ist die MCF (mitochondrial carrier family) (Picault et al., 2004). Transporter dieser Klasse kommen in verschiedenen Pflanzenorganellen, wie Mitochondrien, Plastiden und Peroxisomen vor und verfügen über ein breites Substratspektrum. Sie transportieren Adeninnukleotide, Aminosäuren, Dikarbonsäuren, Phosphat oder andere Metabolite über Membranen. Das Genom von Arabidopsis thaliana kodiert 58 MCF Proteine, von denen aktuell lediglich ein Viertel charakterisiert ist (Palmieri et al., 2011). Alle MCF-Transporter weisen eine dreifach repetitive Struktur, sowie ein charakteristisches Sequenzmotiv auf, welches als mitochondriale Energiesignatur bezeichnet wird (Picault et al., 2004). Diese repetitive Struktur wurde nachfolgend verwendet, um MCF-Mitglieder in 20 verschiedenen Pflanzenproteomen zu identifizieren. Die gefundenen Proteine wurden anhand ihrer biochemischen Transportfunktion in Orthologengruppen unterteilt (Manuskript 1). Anders als aus vorhergehenden Analysen zu erwarten war (Picault et al., 2004), divergierte die Familie mitochondrialer Phosphattransporter in zwei Orthologengruppen. Eine dieser Gruppen umfasste PHT3;1 und PHT3;2, die andere Gruppe enthielt PHT3;3. Es wurde postuliert, dass dieses Protein eine andere Transportfunktion aufweist, da es eine separate Gruppe bildete. Zudem wurde gezeigt, dass die Orthologengruppe mit PHT3;3 nur Sequenzen enthielt, die Landpflanzen zuzuordnen waren. Algen-, Pilz-, oder tierische Sequenzen wurden hingegen nicht gefunden. Daraufhin wurde angenommen, dass PHT3;3 eine pflanzenspezifische Funktion erfüllt. Biochemische Untersuchungen von PHT3;3 zeigten, dass dieses Protein den Import von Sulfat in Mitochondrien bewerkstelligt (Manuskript 2). Folglich wurde PHT3;3 in SIT1 (inorganic sulfate transporter 1) umbenannt. Des Weiteren wurde die physiologische Rolle von SIT1 anhand von Arabidopsis Knockout-Pflanzen untersucht. Da diese Pflanzen stark in ihrer Entwicklung und ihrem Wachstum beeinträchtigt waren, wurde vermutet dass SIT1 und die mitochondrialen Dikarbonsäuretransporter (DIC) möglicherweise gekoppelt agieren, um Dikarbonsäuren im Austausch gegen Sulfat ins Mitochondrium zu importieren. Pflanzen, die SIT1 nicht exprimieren, tauschen möglicherweise mitochondriales Phosphat gegen Dikarbonsäuren aus. Dies könnte in Konsequenz zu einer geringeren ATP-Synthese in Mitochondrien führen, da weniger Phosphat zur Verfügung steht um Energie zu generieren. Solch eine Energieverarmung könnte die Wachstumsphänotypen bedingen, die in sit1 Mutanten beobachtet wurden. Das mögliche Zusammenspiel von SIT1 und DIC wird zukünftig detaillierter untersucht werden. Der Aufbau von Protonengradienten an Membranen und die Regulation des zellulären pH ist von entscheidender Bedeutung für den pflanzlichen Stoffwechsel und Metabolittransport (Gjetting et al., 2012). In dieser Arbeit wurde der peroxisomale pH anhand eines pH-sensitiven grün fluoreszierenden Proteins untersucht, welches in Peroxisomen unterschiedlicher Arabidopsisgewebe exprimiert wurde. Messungen zeigten, dass der pH in etioliertem Sprossgewebe sauer ist, während hingegen der pH in Wurzelperoxisomen alkalisch ist (Manuskript 3). Dieses Ergebnis impliziert eine funktionale Differenzierung von Wurzelperoxisomen und Sprossperoxisomen. Letztere bewerkstelligen hauptsächlich den Abbau von Fettsäuren mittels β-Oxidation und Glyoxylatzyklus (Hayashi and Nishimura, 2003). Um festzustellen, ob der saure pH in fettabbauenden Peroxisomen unmittelbar durch den Metabolismus bedingt wird, haben wir diesen in Hypokotylperoxisomen einer Arabidopsismutante untersucht, die ein defektes peroxisomales ATP-Importsystem aufweist. Die peroxisomale Zufuhr von ATP ist essentiell für den Abbau von Fettsäuren und erfolgt mittels der peroxisomalen Adeninnukleotidtransporter 1 und 2 (PNC1, PNC2) (Linka et al., 2008). Wir nahmen an, dass der Import von ATP entweder protonenkompensiert ist, was zur Ansäuerung des peroxisomalen Lumens führen könnte, oder dass β-Oxidation und der Glyoxylatzyklus selbst zu einer Erniedrigung des pH in Peroxisomen führen, da diese Stoffwechselwege Säuren freisetzen. Untersuchungen zeigten, dass β-Oxidation und Glyoxylatzyklus nicht für die pH Ansäuerung in Peroxisomen verantwortlich sind, da der peroxisomale pH in Arabidopsismutanten, die PNC1 und PNC2 nicht exprimieren, unverändert sauer war. Aufgrund dieser Ergebnisse wurde eine Folgestudie durchgeführt (Addendum VII.1). Diese zeigte, dass unter Gabe des spezifischen P-Typ ATPase Inhibitors ortho-Vanadat (Dröse and Altendorf, 1997) der pH in Hypokotylperoxisomen auf Wildtyplevel (pH 7.2) anstieg, was impliziert dass Peroxisomen über P-Typ ATPasen verfügen könnten. Ob diese ATPasen den peroxisomalen pH regulieren, wird in zukünftigen Experimenten untersucht werden. Zusammenfassend hat diese Doktorarbeit dazu beigetragen das Wissen über die MCF Familie in pflanzlichen Mitochondrien und Peroxisomen zu vertiefen, indem (i) eine Methode entwickelt wurde effizient MCF Proteine in multiplen Pflanzenproteomen zu identifizieren. Zudem wurde (ii) der mitochondrialen Sulfattransporter SIT1 charakterisiert, (iii) der Einfluss der MCF Transportproteine PNC1 und PNC2 auf den peroxisomalen pH, sowie (iv) die Rolle von ATPasen in der Regulation des peroxisomalen pHs untersucht.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Biochemie der Pflanzen
Dokument erstellt am:	18.12.2013
Dateien geändert am:	18.12.2013
Promotionsantrag am:	21.11.2013
Datum der Promotion:	12.12.2013