Dokument: Expression, Reinigung und biophysikalische Charakterisierung von humanen Presenilin 2

Titel:	Expression, Reinigung und biophysikalische Charakterisierung von humanen Presenilin 2
Weiterer Titel:	Expression, purification and biophysical characterization of human Presenilin 2
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=27810
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20131205-160617-3
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Msc. Yang, Ge [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 9,75 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 03.12.2013 / geändert 03.12.2013
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Preseniline sind Teil des γ-Sekretase Komplexes, welcher aus vier verschiedenen Proteinen besteht. Der Komplex spielt eine wichtige Roll in der Entwicklung von Morbus Alzheimer. Die Spaltung von APP-C99 durch γ-Sekretase erzeugt das amyloid beta-peptid, welches die Hauptkomponente der amyloiden Plaques ist. Die Preseniline sind die katalytische Untereinheit der γ-Sekretase, welche nach Aktivierung durch Spaltung in eine N- und eine C-terminale Domäne innerhalb der Membran proteolytisch aktiv sind. Strukturelle Informationen über die Presenilin Moleküle und den γ-Sekretase sind notwendig, um die Aktivität der γ-Sekretase und ihren Wirkmechanismus zu verstehen. In dieser Arbeit wurden das humane PS2 (PS2-FL) und das N-terminale (PS2-NTF) und das C-terminale Fragment (PS2-CTF) heterolog in in E.coli sowie in vitro exprimiert, um einer erste Charakterisierung des Proteins zu erreichen, und hinreichend Material hinreichender Qualität für weiterführende strukturelle Untersuchungen durch Röntgenkristallographie bzw. NMR-Spektroskopie zu erhalten. Durch Optimierung der Expressionsbedingungen und die Verwendung Codon-optimierter DNA-Konstrukte ließen sich PS2-FL und PS2-NTF zu 1-2 mg/l Kultur in E. coli exprimieren. Die Reinigung von PS2-FL erfolgte unter nativen und denaturierenden Bedingungen durch eine Kombination von Affinitätschromatographie und Gelfitration. Hierbei zeigte sich das PS2-FL im Gleichgewicht von Hexamer und als Trimer vorliegt. Die beobachtete Neigung von PS2-FL, besonders nach Rückfaltung, zu aggregieren, scheint in Zusammenhang mit einer instabilen Tertiärstruktur zu stehen. Eine strukturelle Instabilität der Tertiärstruktur eines Proteins, dessen Domänen nach Spaltung Teil der Quartästruktur eines Proteinkomplexes werden, könnte allein durch die mangelnde Stabilisierung der Domänenanordnung in Abwesenheit der anderen Proteine des Komplexes verursacht sein. Tatsächlich zeigen die funktionalen Domänen andere Formen von Oligomerisierung als das Gesamtprotein. CD und Fluoreszenzmessungen an rückgefaltetem His-PS2-FL, welches in kubische Phase von Monoolein rekonstituiert wurde, zeigte dass das es alle Charakteristika eines α–helicalen Proteins besitzt, und die Tryptophane sich in einer relativ unpolaren Umgebung befinden. Daher konnten erste Kristallisationsexperimente durchgeführt werden. Die biophysikalische Charakterisierung von PS2-NTF zeigte den höchsten Anteil an helicaler Struktur und maximale Fluoreszenz in Foscholin-12, wodurch sich dieses Detergenz als am besten geeignet erwies. Das CD-Spektrum von PS2-NTF im nahen UV zeigt die distinkten Signale für Tertiärstruktur mit einer gut definierten negativen Bande zwischen 255 und 300 nm. Dies unterstützt die Interpretation, dass es sich bei dem PS2-NTF Dimer um den nativen Zustand des Proteins handelt. Weitere Evidenz für die Hypothese, dass die beobachtete Aggregation von Presenilin auf eine instabile Domänenanordnung zurückzuführen ist, wurde durch die Untersuchung der Thermostabilität des PS2-NTF Dimers durch CD- und Fluoreszenzspektroskopie gefunden, die erwies, dass diese Domäne mit einem Schmelzpunkt Tm von 56.8±1.9 ℃, als relativ stabil anzusehen ist. Die Dekonvolution der CD-Spectren ergab, dass mit zunehmender Temperatur eine Strukturumwandlung von α-helikal nach β-Strang von 62 Aminosäuren stattfand, wenn die Temperatur von 20° nach 90°C erhöht wurde. Die C-terminale Domäne PS2-CTF war in E. coli nur gering exprimierbar, sie konnte besser durch in vitro Expression erhalten werden. Zur Optimierung der in vitro Expression wurde neben einer Untersuchung des Einflusses der verwendeten Detergenzien auch eine direkte Rekonstitution in lipidhaltige nanodiscs (MSP Protein) untersucht. Die Ausbeute an PS2-CTF von ca. 1mg/ml in in vitro Reaktion in Form von monodispersem rekonstituierten PS2-CTF erlaubt weitergehende NMR Untersuchungen der Struktur. Bemerkenswerterweise war die Oligomerisierung von PS2-CTF vom Lipid abhängig: Während in Foscholin-12 ein Tetramer vorlag, fand sich in DMPC ein Oktamer. Dagegen bildete die einzeln exprimierte N-terminale Domäne ein stabiles Dimer. Die Analyse des Oligomerisierung von Presenilin zeigte, dass sie vom Prozessierungszustand (der Aktivierung durch Spaltung) und der der Umgebung abhängt, speziell von den Lipiden. Dies erklärt warum bisher γ-Sekretase-komplexe unterschiedlicher Stöchiometrie gefunden wurden. Presenilin proteins are part of the γ-secretase complex which consists of four different membrane proteins. This complex plays an important role in the development of Alzheimer's disease. The cleavage of APP-C99 by γ-secretase generates the amyloid beta peptide which is the major component of amyloid plaques. Presenilins are considered to be the catalytic subunit of γ-secretase. They are activated by auto-cleavage into its N-terminal and C-terminal domain to act as a protease within the membrane. Structural information of presenilins and the γ-secretase are of great importance to understand the activity of the complex and its mechanism of action. In the presented work, human PS2 full length (PS2-FL) and its N-terminal domain (PS2-NTF) as well as its C-terminal domain (PS2-CTF) were heterologously expressed in E.coli via in vivo or by in vitro expression in order to characterize the proteins and to obtain material of sufficient quantity and quality for structural investigation via X-ray crystallography or NMR spectroscopy. By optimization of the expression conditions and using codon-usage optimized DNA, PS2-FL and PS2-NTF can be expressed with a level of about 1 to 2 mg per liter culture via in vivo expression. Purification of PS2-FL was performed under native and denaturing condition by a combination of affinity chromatography and SEC. SEC analysis revealed that PS2-FL exists in equilibrium of hexamer and trimer. The observed tendency of the protein to aggregate, especially material obtained by refolding, appears to be caused at least partially by instability of the tertiary structure. A structural instability of a tertiary structure of a protein whose domains will be part of the quaternary structure of a protein complex after cleavage may be simply caused by flexibility of the domain assembly in the absence of other proteins of the complex. Indeed, the functional domains of PS2 show different oligomerisation than the full-length protein. CD and fluorescence spectroscopy measurements of the refolded His-PS2-FL reconstituted into MO cubic phase revealed that the protein still exhibits the characteristics of a predominantly α–helical protein and the localisation of the tryptophan side chains in a relatively non-polar environment. Therefore first crystallization experiments were performed in monoolein based cubic meso-phase. The biophysical characterization of PS2-NTF showed the highest fraction of helical structure as well as the highest fluorescence in FC12, which indicated this detergent to be most compatible with the protein. The near UV CD spectrum of PS2-NTF in FC12 displayed the characteristics of a distinct tertiary structure peaks with strong, well-defined, negative bands between 255 and 300 nm. The PS2-NTF dimer probably represents the native state of the protein as supported by the near UV CD data. Thermal stability of the PS2-NTF dimer in FC12 was investigated by far UV CD and fluorescence spectroscopy. The MRE at 221 nm as a function of temperature could be fitted with a two-state unfolding transition. The obtained Tm value of 56.8±1.9 ℃ indicated that the protein secondary structure is relatively stable, which provided further evidences for the hypothesis that the observed aggregation of the full-length protein is due to instability of domain positioning. Deconvolution of the raw CD spectra at different temperatures into pure component spectra revealed a strongly correlated decrease of α-helical and an increase of β-strand structure, indicating a structural transformation of about 62 amino acids from α-helix to β-strand structure when the temperature increases from 20° to 90°C. PS2-CTF expressed poorly in vivo and could be obtained via in vitro translation. In vitro translation was carried out using different forms of solubilisation to improve the yield and the homogeneity of PS2-CTF. The direct reconstitution into lipid-containing nanodiscs (MSP protein) gave a yield of ca. 1 mg per ml in vitro reaction. SEC elution profile revealed a monodispersed peak of PS2-CTF-nanodiscs complex suitable for structural analysis via solution NMR. Interestingly the oligomerisation of PS2-CTF is lipid dependent: While it forms a tetramer in FC12, in the presence of DMPC it exists as an octamer. However, for the separately expressed domains the oligomerisation was found to be a mono-dispersed dimer for PS2-NTF. The SEC analysis revealed that for presenilin various different modes of oligomerisation exist which depend on the state of processing (activation by cleavage) and the environment, specifically the lipids. This explains why previously γ-secretase complexes of different stoichiometry were reported.
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Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät
Dokument erstellt am:	05.12.2013
Dateien geändert am:	05.12.2013
Promotionsantrag am:	12.11.2012
Datum der Promotion:	18.12.2012