Dokument: Hemmung der Angiogenese in vitro durch Antisense-Oligonukleotide gegen die αv-Kette des Vitronectin-Rezeptors

Titel:	Hemmung der Angiogenese in vitro durch Antisense-Oligonukleotide gegen die αv-Kette des Vitronectin-Rezeptors
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=2781
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20040324-000781-2
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Gräf, Thorsten [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 2,43 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 09.02.2007 / geändert 09.02.2007
Beitragende:	Prof. Dr. Haas, Rainer [Gutachter] Prof. Dr. Bojar, Hans [Gutachter]
Stichwörter:	alpha V Integrin, Angiogenese, Antagonist, Antisense Oligonukleotide, lokale mRNA Struktur, HUVECalpha V integrin, angiogenesis, antagonist, antisense oligonucleotide, local mRNA structures, HUVEC
Dewey Dezimal-Klassifikation:	600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften » 610 Medizin und Gesundheit
Beschreibungen:	Das Integrin αvβ3 spielt eine zentrale Rolle in der Angiogenese. In dieser Arbeit ha-ben wir Antisense-Oligodesoxyribonukleotide (ODN) gegen die mRNA der αv-Kette des Integrin Rezeptors αvβ3 verwendet, um die Proteinexpression zu hemmen. Um geeignete lokale Zielsequenzen zu ermitteln, wurde Computer-unterstützt die Sekun-därstruktur der αv-mRNA errechnet. Basierend auf den Sekundärstrukturanalysen wurden neben zwei Antisense-ODN gegen das Translationsinitiationskodon AUG zehn verschiedene Antisense-ODN gegen fünf potentiell geeignete Zielregionen auf der αv-mRNA ausgewählt und in "Human umbilical vein endothelial cells" (HUVEC) unter Verwendung eines kationischen Lipids als Karrier tranzfiziert. Acht Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen mit Phorbol 12-Myristat 13-Acetat (PMA) stimuliert, um die αv-Expression zu induzieren. Mit Hilfe der anschließenden Durch-flußzytometrie und der quantitativen "Real-Time" RT-PCR wurde die Wirksamkeit der verschiedenen Antisense-ODN gemessen. Es zeigte sich, dass drei der zwölf Anti-sense-ODN die Hochregulierung der αv-Expression auf Protein- und mRNA-Ebene bei einer ODN-Konzentration von 0,05 µM komplett unterdrücken konnten. Vier der verwendeten Antisense-ODN zeigten eine Inhibition der αv-Expression zwischen 60% und 80%. Fünf Antisense-Sequenzen hatten keinen signifikanten Einfluss. Die Hemmung der αv Protein-Expression war mit einer Hemmung der Migrationsfähigkeit der HUVEC´s von 48% assoziiert. Weiterhin zeigte sich, dass die Transfektion mit Antisense-ODN die Bildung von tubulären Strukturen der HUVEC in einer extrazellulären Matrix aus Matrigel um 44% im Vergleich zu Kontroll-ODN-transfizierten Zellen hemmen konnte. Zur weiteren Beurteilung des anti-angiogenetischen Potentials unserer Antisense-ODN verwendeten wir ein Zellkultur-Modell der menschlichen Angio-genese, welches aus einer Co-Kultur von Endothelzellen und dermalen Fibroblasten bestand. Verglichen mit unbehandelten Zellen, konnte die Bildung Kapillar-ähnlicher Strukturen in der Zellkultur durch Transfektion mit αv-gerichteten Antisense-ODN um 64% gedrosselt werden. Die Schlussfolgerung aus unseren Experimenten ist, dass die von uns entwickelten Antisense-ODN gegen die αv-Kette des αvβ3 Integrins eine potentielle Inhibition der Angiogenese in vitro darstellen. Sie sind möglicherweise eine nützliche Alternative oder Ergänzung zu Antagonisten, die direkt an das αvβ3-Integrin binden. Sie könnten daher therapeutisch bei der Bekämpfung von malignen Tumoren oder malignen hä-matologischen Erkrankungen eingesetzt werden. The integrin αvβ3 plays a central role in angiogenesis since ist upregulation on endothelial cells promotes migration and sustains survival of vascular cells in angiogenic blood vessels. In this study, we used antisense oligodesoxyribonucleotides (ODN) directed against the αv chain of αvβ3 to inhibit integrin expression. To identify favorable target sequences a systematic alignment of computer-predicted secondary structures of local sequence stretches of the αv mRNA was performed. Ten ODN sequences were selected on a theoretical basis and were transfected into human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) using cationic lipids. Cells were stimulated with phorbol 12-myristate 13 acetate 8 hours following transfection to induce αvβ3expression. As assessed by flow cytometry and quantitative real time RT-PCR one out of ten antisense ODN inhibited the upregulation of αv mRNA and protein completely at an ODN concentration of 0.05 µM. Four antisense ODN showed an inhibition of protein expression between 60% and 80% and five sequences had no inhibitory effect. Using the most effective antisense ODN the inhibition of αv expression was associated with an inhibition of the migratory capacity of HUVEC by 43% and had no effect on the proliferation and apoptosis rate. Moreover, transfection of antisense ODN inhibited the formation of tube-like structures of HUVEC in the extracellular matrix preparation Matrigel by 52% in comparison with control ODN-transfected cells. To evaluate the anti-angiogenic potential of the antisense ODN a cell culture model of human angiogenesis was used consisting of a co-culture of endothelial cells with dermal fibroblasts. In comparison with untreated cells, transfection of αv-directed antisense ODN resulted in a dose-dependent inhibition of tube formation ranging between 39% and 64%. In conclusion, antisense ODN are potent inhibitors of angiogenesis in vitro. Therefore, antisense ODN might be a therapeutic alternative to antagonists which directly bind to αv integrins and might be useful for the treatment of inflammatory diseases, malignant tumors and hematological malignancies.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Medizinische Fakultät
Dokument erstellt am:	24.03.2004
Dateien geändert am:	12.02.2007
Promotionsantrag am:	09.02.2004
Datum der Promotion:	09.02.2004