Dokument: Mechanismen der Qualitätskontrolle bei der Sec-abhängigen Proteintranslokation in Gram-positiven Bakterien

Titel:	Mechanismen der Qualitätskontrolle bei der Sec-abhängigen Proteintranslokation in Gram-positiven Bakterien
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=2778
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20040319-000778-7
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Köberling, Oliver [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 2,36 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 09.02.2007 / geändert 09.02.2007
Beitragende:	Prof. Dr. Freudl, R. [Gutachter] Prof. Dr. Ernst, Joachim F. [Gutachter]
Stichwörter:	Proteinsekretion, Proteintranslokation, Proteinexport, Qualitätskontrolle, Bakterien, Gram-positiv, Bacillus, Sec, Sec-Wegprotein secretion, protein export, protein translocation, quality control, bacteria, gram-positive, Bacillus, Sec, Sec pathway
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Die Translokation von Proteinen über die bakterielle Cytoplasmamembran wird von der Sec-Translokase katalysiert. Diese besteht aus dem SecA Protein, welches die Exportproteine in Abhängigkeit von ATP durch wiederholte Zyklen von Membraninsertion und -deinsertion durch den Translokationskanal, bestehend aus SecY, SecE und SecG, schleust. Für die Initiation der Translokation ist die Bildung eines funktionellen Komplexes bestehend aus SecA, SecY und dem Exportprotein essentiell. Dieser Schritt stellt eine Qualitätskontrolle dar, die bezüglich der zelleigenen Proteine zur Unterscheidung zwischen cytosolischen und Exportproteinen dient und bei der sekretorischen Gewinnung heterologer Proteine einen schwerwiegenden Engpass darstellen kann. In dieser Arbeit wurden molekulare Mechanismen, die innerhalb des Translokations-Initiationskomplexes für die Qualitäts-kontrolle entscheidend sind, im Detail untersucht. Ausgangspunkt der Untersuchungen war eine Bacillus subtilis SecA-Austauschmutante (RMA), in der das B. subtilis secA Gen gegen das Staphylococcus carnosus secA Gen auf dem Chromosom ausgetauscht wurde. Dieser Austausch hat eine erhöhte Qualitätskontrolle der Hybridtranslokase zur Folge, die zu einem konditionalen Wachstumsdefekt aufgrund pleiotroper Exportdefekte bei 25 °C und interessanterweise zu einem selektiven Ausschluss eines heterologen Proteins (des OmpA Protein von E. coli) auch bei der permissiven Temperatur (37 °C) führt. Weitere Folgen des SecA Austausches sind ein Sporulations- und Kompetenzdefekt. In dieser Arbeit wurden sieben spontane Suppressormutanten der RMA isoliert und charakterisiert, die aufgrund der Fähigkeit, das kältesensitive Wachstum bzw. den Sporulationsdefekt zu supprimieren, selektioniert wurden. Interessanterweise exportierten diese Mutanten nun auch das heterologe OmpA wieder besser als die RMA, was auf eine, im Vergleich zur RMA, herabgesetzte Qualitätskontrolle hindeutete. Die Bestimmung der Mutationsorte zeigte, dass alle Mutanten Veränderungen im SecA von S. carnosus enthielten. Überraschenderweise entsprachen die Positionen von vier Mutationen exakt den Positionen bekannter Mutationen im SecA von E. coli, die eine Erhöhung der ATPase Aktivität von SecA zur Folge haben (?super-aktives? SecA). Daher ist es sehr wahrscheinlich, dass die entsprechenden Mutationen auch im S. carnosus SecA zu einer Erhöhung der ATPase Aktivität führen, wodurch der Export des heterologen OmpA wieder ermöglicht wird. Dieses Ergebnis lässt darauf schliessen, dass die schlechte Aktivierung der SecA ATPase durch das heterologe OmpA den kritischen Schritt bei der Translokation in der RMA darstellt. Eine Mutation lag in einem Bereich, der, wie vom SecA aus E. coli bekannt ist, mit SecY wechselwirkt. Daraus kann geschlossen werden, dass die Wechselwirkungen zwischen dem SecA von S. carnosus und dem SecY von B. subtilis aufgrund der Mutation optimiert wurden, wodurch auf diese Weise eine Aktivierung der SecA ATPase durch das heterologe OmpA ermöglicht wurde. Da die RMA ein artifizielles System darstellt, wurde untersucht, ob durch Übertragung von Mutationen aus dem S. carnosus SecA auf die entsprechenden Positionen im B. subtilis SecA ein positiver Effekt auf die Proteintranslokation auch im B. subtilis Wildtyp erreicht werden kann. Die Übertragung von fünf Einzelmutationen führte in drei Fällen tatsächlich zu einem verbesserten Export einer Variante der alkalischen Phosphatase PhoB, die im B. subtilis Wildtyp nur sehr schlecht exportiert wird. Dies lässt auf eine konservierte Funktion der veränderten Aminosäuren bei Regulation der ATPase Aktivität im S. carnosus und B. subtilis SecA schließen. Die in dieser Arbeit erhaltenen Ergebnisse lassen die Schlussfolgerung zu, dass die Fähigkeit eines heterologen Proteins, die SecA ATPase zu aktivieren, für die Effizienz der Translokation von entscheidender Bedeutung ist. Eine schlechte Aktivierung kann umgangen werden, indem entweder Wechselwirkungen zwischen SecA und SecY und dem Vorläuferprotein optimiert werden oder das SecA Protein in einen pre-aktivierten Zustand gebracht wird. Da auch das SecY ein essentieller Bestandteil des Transloktions-Initiationskomplexes ist, wurde untersucht, ob sich auch Veränderungen im SecY von B. subtilis positiv auf den Proteinexport auswirken. Von mehreren gezielt eingefügten Mutationen in Bereichen, die im E. coli SecY an der Qualitätskontrolle beteiligt sind, führten zwei Mutationen im Transmembransegment 10 tatsächlich auch zu einer verbesserten Translokation der im B. subtilis Wildtyp nur schlecht exportierbaren Variante der alkalischen Phosphatase. Dies zeigte, dass neben dem SecA Protein auch das SecY Protein einen wichtigen Bestandteil des Qualitätskontrollsystems der Translokase von B. subtilis darstellt. Translocation of proteins across the bacterial cytoplasmic membrane is catalyzed by the Sec- translocase consisting of the SecA ATPase and the transmembrane proteins SecY, SecE and SecG. SecA mediates the stepwise translocation of the export protein by ATP dependent cycles of insertion and deinsertion into the SecYEG channel. Initiation of translocation requires the formation of functional interactions between at least SecA, SecY and the precursor protein. This proofreading mechanism ensures that among the homologous proteins only those designated for export are translocated. During the secretion of heterologous proteins this quality control step can cause a severe bottleneck. To investigate the molecular mechanisms underlying the quality control in vivo a Bacillus subtilis SecA replacement mutant (RMA) containing a clean chromosomal replacement of the B. subtilis secA gene by the secA gene of Staphylococcus carnosus was used as a genetic tool. This gene replacement results in an artificially increased proofreading activity of the hybrid translocase resulting in a conditional growth defect at 25 °C due to pleiotropic export defects at low temperature. In contrast, the heterologous outer membrane protein A (OmpA) of Escherichia coli is selectively excluded from export even at the permissive temperature (37 °C). Furthermore the RMA shows defects in sporulation and development of genetic competence. In this work spontaneous mutants of the RMA were selected for suppression of the cold sensitive growth and the sporulation defect, respectively. Interestingly, all suppressor mutants now also showed an improved OmpA export suggesting a reduced quality control activity compared to the RMA. The identification of the mutations of seven mutants showed that the suppressors contained single amino acid exchanges in the SecA of S. carnosus. Suprisingly, the positions of four mutations correspond exactly to the positions of known mutations in the SecA of E. coli resulting in a pre-activation of the SecA protein by elevation of the basal ATPase activity (?super-active? SecA). Therefore it is very likely that the respective mutations of the suppressor mutants restore the OmpA export by super-activation of the S. carnosus SecA protein. This strongly suggests that in the RMA a non optimal activation of the SecA ATPase activity by the heterologous OmpA protein is the limiting step during translocation. Another mutation was located in a region of the S. carnosus SecA which, as identified in the SecA of E. coli, interacts with SecY. This strongly suggests that in this mutant the activation of the SecA ATPase by the OmpA is restored by optimized interactions between the SecA of S. carnosus and the SecY of B. subtilis. Since the RMA is an artificial genetic system, five single mutations were transferred independendly into the corresponding positions of the SecA of B. subtilis. Expression of three mutated SecA proteins in the homologous background indeed resulted in a more than 3-fold improved export of a variant on the B. subtilis alkaline phosphatase PhoB which is only poorly exported in the B. subtilis wildtype. This suggests a conserved function of the respective amino acid residues in the regulation of the ATPase activity in the B. subtilis and S. carnosus SecA. The results obtained in this study show for the first time that the efficiency of translocation of a heterologous protein is dependent on its ability to activate the SecA ATPase. A non optimal activation can be bypassed either by optimizing interactions between SecA, SecY and the export protein or by pre-activating SecA. Since the SecY protein is another important component of the translocation initiation complex several mutations which result in a reduction of the proofreading activity when present in the transmembrane segment 10 of the E. coli SecY were introduced into the corresponding positions of the B. subtilis SecY. Indeed, in two cases the export of the PhoB variant was significantly improved, clearly showing that SecA and SecY are essential components of the quality control system of the B. subtilis translocase and variations in either of the subunits can improve the translocation of proteins which are only poorly exported in a B. subtilis wildtype strain.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie
Dokument erstellt am:	19.03.2004
Dateien geändert am:	12.02.2007
Promotionsantrag am:	23.07.2003
Datum der Promotion:	23.07.2003