Dokument: Etablierung FRET-basierter Biosensoren zur quantitativen Detektion von Sauerstoff in Escherichia coli

Titel:	Etablierung FRET-basierter Biosensoren zur quantitativen Detektion von Sauerstoff in Escherichia coli
Weiterer Titel:	Establishment of FRET-based biosensors for the quantitative detection of oxygen in Escherichia coli
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=27685
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20131118-092217-4
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Potzkei, Janko [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 6,42 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 15.11.2013 / geändert 15.11.2013
Beitragende:	Prof. Dr. Jaeger, Karl-Erich [Gutachter] PD Dr. Pohl, Martina [Gutachter]
Stichwörter:	Biosensor, FRET, Sauerstoff, E.coli, Sauerstoffkonzentration, in vivo
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	In der heutigen Zeit ist es in der Biotechnologie, Biomedizin und in der Grundlagenforschung von großem Interesse, Sauerstoffkonzentrationsänderungen, nicht-invasiv mit einem genetisch kodierten Biosensor detektieren und quantifizieren zu können. So könnte die Physiologie von hypoxischen Geweben, wie zum Beispiel Tumorzellen besser untersucht und verstanden werden. Die korrekte Bestimmung der intrazellulären Sauerstoffkonzentration und deren Änderungen könnte außerdem zum besseren Verständnis vieler (patho)-physiologischen Prozessen in verschiedenen pro- und eukaryotischen Organismen sowie in menschlichen Geweben beitragen. Des Weiteren könnte ein solcher Biosensor vielfältige Anwendung in der Biotechnologie bzw. Verfahrenstechnik zur Optimierung von Fermentationsprozessen finden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde daher ein neuartiger Fluoreszenzprotein-basierter Biosensor entwickelt, der Änderungen von Sauerstoffkonzentrationen in lebenden Systemen auch über mehrere Stunden (bis zu 20h, vgl. Kap. 3.8.2) ermöglicht. Bei dem Biosensor handelt es sich um ein Fusionsprotein, das aus einer Sauerstoff-insensitiven Fluoreszenzdomäne, dem FMN-bindenden Fluoreszenzprotein (FbFP) und einer Sauerstoff-sensitiven Fluoreszenzdomäne, dem gelb-fluoreszierenden Protein YFP, besteht. Im Rahmen dieser Arbeit wurde zunächst mithilfe verschiedener spektroskopischer Nachweisverfahren gezeigt, dass aufgrund der spektralen Überlappung des FbFP-Emissionsspektrums und des YFP-Absorptionsspektrums eine sogenannte Förster-Resonanzenergietransfer- oder FRET-Kopplung zwischen der Donordomäne (FbFP) und der Akzeptordomäne (YFP) erfolgen kann. Zudem wurde durch eine hydrolytische Spaltung der beiden Fluoreszenzdomänen nachgewiesen, dass es sich bei dem Phänomen um einen intramolekularen Prozess handeln muss. Anschließend wurde mit umfangreichen in vivo Studien die Anwendbarkeit der FbFP-YFP-Fusion als FRET-basierter O2-Biosensor in Bakterienzellen nachgewiesen. Diese Studien wurden in dem Mikrobioreaktor BioLector durchgeführt, der eine konstante Überwachung der Biomasse sowie der Gelöstsauerstoff-Konzentration während einer E. coli-Batchkultivierung ermöglichte. Parallel wurden die intrazellulären Veränderungen der O2-Konzentrationen mithilfe des FRET-Biosensors bestimmt. Hierbei diente die Fluoreszenzintensitäten des FRET-Donors und –Akzeptors als ein Maß für den zellulären Sauerstoffgehalt: Erhöhte Sauerstoffkonzentrationen führten zu einer hohen YFP-Fluoreszenz, die aufgrund eines effektiven FRET-vermittelten Quenchings gleichzeitig eine Abnahme der FbFP-Fluoreszenz zur Folge hatte. Im Gegensatz dazu führte eine Limitierung des intrazellulären Sauerstoffgehalts, die z. B. durch die hohe respiratorische Aktivität der Bakterienzellen in der exponentiellen Wachstumsphase auftrat, zu einer unvollständigen Ausbildung der YFP-Fluoreszenz. Dies hatte wiederum eine Zunahme der FbFP-Fluoreszenz aufgrund der fehlenden FRET-Kopplung zur Folge. Zur Kalibrierung des Sauerstoffbiosensors wurde die Sauerstoffkonzentration im Medium mit den Fluoreszenzsignalen der YFP-FbFP-Fusion korreliert. Es konnte hierbei gezeigt werden, dass das FRET-Verhältnis als Funktion der Zeit den Veränderungen der extrazellulären Sauerstoffkonzentration in einem Konzentrationsbereich von 0 bis 0,08 mmol/l folgt. Somit wurde zum ersten Mal ein genetisch kodierter, ratiometrischer Biosensor erzeugt, der eine nicht-invasive Überwachung der intrazellulären Sauerstoffkonzentration mit einer hohen zeitlichen und räumlichen Auflösung erlaubt (Potzkei et al., 2012). Analog zum Sauerstoff-Biosensor konnte im Rahmen dieser Arbeit ein FRET-Biosensor entwickelt werden, mit dem es möglich ist, pH-Wert Änderungen sowohl in vitro als auch in vivo in einem pH-Bereich von 4.0 bis 8.0 zu detektieren. Dabei wurde das Fluoreszenzprotein FbFP als pH-insensitive FRET-Donordomäne und die pH-sensitive YFP-Variante Citrine als entsprechende Akzeptordomäne verwendet. Mithilfe dieses Biosensors konnte die Funktion des H+-Ionophors Nigericin in lebenden E. coli-Zellen mit einem bildgebenden Verfahren nachgewiesen werden. At the present time it is of great interest in biotechnology, biomedical and basic research to be able to detect and quantify changes of oxygen concentration to non-invasively with a genetically encoded biosensor. How could the physiology of hypoxic tissues, such as tumor cells are better studied and understood. The correct determination of the intracellular oxygen concentration and its changes could also contribute to a better understanding of many (patho) physiological processes in various prokaryotic and eukaryotic organisms and in human tissues. Furthermore, such a biosensor could find numerous applications in biotechnology and process technology for the optimization of fermentation processes. In this paper, a novel fluorescent protein-based biosensor was developed to allow the detection of changes of oxygen concentrations in living systems over several hours (up to 20h, see Section 3.8.2). The biosensor is a fusion protein consisting of an oxygen-insensitive fluorescent domain, FMN binding fluorescent protein (FbFP) and an oxygen-sensitive fluorescent domain, the yellow fluorescent protein YFP. In this work, initially using various spectroscopic detection methods has been shown that due to the spectral overlap of the FbFP emission spectrum and YFP absorption spectrum can be a so-called Förster resonance energy transfer, or FRET coupling between the donor domain (FbFP) and the acceptor domain (YFP). It was also demonstrated by a hydrolytic cleavage of the two fluorescent domains, which it must be at the phenomenon to an intramolecular process. The applicability of FbFP-YFP fusion was detected as FRET-based biosensor O2 in bacterial cells in vivo studies. These studies were carried out in the micro BioLector bioreactor that allowed a constant monitoring of the biomass, the dissolved oxygen concentration during batch cultivation of E. coli. In parallel, the intracellular change of O2 concentrations was determined using the FRET biosensor. Here, the fluorescence intensities of the FRET donor and acceptor were used as a measure of cellular oxygen content: Increase concentrations of oxygen resulted in a high YFP fluorescence simultaneously in a decrease in FbFP fluorescence resulted because an effective FRET-mediated quenching. In contrast, a limitation resulted in intracellular oxygen content, which occurred because of the high respiratory activity of the bacterial cells in the exponential growth phase, for example, an incomplete formation of YFP fluorescence. This in turn had a FbFP increase in fluorescence due to the lack of FRET coupling result. To calibrate the O2-biosensors with oxygen concentration in the medium is correlated with the fluorescent signals of the YFP-FbFP fusion. It was here demonstrated that the FRET ratio as a function of time the changes following in the extracellular concentration of oxygen in a concentration range of 0 to 0.08 mM /l. Thus, for the first time a genetically encoded; ratiometric biosensor was produced, which allows non-invasive monitoring of intracellular oxygen concentration with a high temporal and spatial resolution (Potzkei et al., 2012). Analogous to the oxygen biosensor could be a FRET biosensor developed in this work, with which it is possible to detect pH changes in both in vitro and in vivo in a pH range from 4.0 to 8.0. Here, the fluorescent protein was used as FbFP pH-insensitive FRET donor domain and the pH-sensitive YFP variant Citrine than corresponding acceptor domain. Using this biosensor, the function of the H + ionophore Nigericin could be detected in living E. coli cells with an imaging procedure.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Enzymtechnologie
Dokument erstellt am:	18.11.2013
Dateien geändert am:	18.11.2013
Promotionsantrag am:	15.11.2012
Datum der Promotion:	11.01.2013