Dokument: Stereoselective synthesis of vicinal diols with enzymatic cascade reactions

Titel:	Stereoselective synthesis of vicinal diols with enzymatic cascade reactions
Weiterer Titel:	Stereoselektive Synthese von vicinalen Diolen durch enzymatische Kaskadenreaktionen
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=27545
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20140213-104700-8
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Kulig, Justyna [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 27,43 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 31.10.2013 / geändert 31.10.2013
Beitragende:	PD Dr. Pohl, Martina [Gutachter] Prof. Urlacher, Vlada [Gutachter]
Stichwörter:	alcohol dehydrogenase, asymmetric synthesis, biocatalysis, cascade reaction, cofactor regeneration, vicinal diol
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Alcohol dehydrogenases are of high interest for the stereoselective synthesis of building blocks with multi-chiral centres. They are implemented for single enzymatic reduction or oxidation steps or be part of synthetic enzymatic multi-step cascades for the production of industrially relevant chiral synthons. Although biotransformations with alcohol dehydrogenases are widespread, enzymes, which accept sterically demanding substrates, especially α-hydroxy ketones, are not common in nature. Therefore chemical methods for the synthesis of chiral 1,2-diols are still first choice. As a drawback, alcohol dehydrogenases require expensive nicotinamide cofactors such as NAD(H) or NADP(H) for their activity. Prices of these cofactors prevent their application in stoichiometric amounts and therefore regeneration of nicotinamide cofactors is an essential issue for biotechnological purposes. Therefore a co-substrate is required that is transformed to the respective co-product in equimolar amounts relative to the product. This co-product has to be separated from the product or must be removed in situ, which decreases atom- and process economy. In this work the carboligation of two inexpensive aldehydes catalysed by ThDP-dependent enzymes is combined with a subsequent reduction of the intermediately formed α-hydroxy ketone by alcohol dehydrogenases. Therefore, a suitable cofactor regeneration system with smart in situ co-product removal had to be developed in order to gain high eco-efficiency of the synthetic enzyme cascade. To achieve the aim, the following work packages were addressed: 1. Investigation of the substrate range of eight available alcohol dehydrogenases with focus on reduction of bulky-bulky α-hydroxy ketones; 2. Determination of the stereoselectivity of the first and the second step of the synthetic cascade; 3. Selection of the most promising enzyme(s) for the reduction of α-hydroxy ketones (which turned out to be the alcohol dehydrogenase from Ralstonia sp.) and its detailed biochemical characterisation with focus on the reduction of α-hydroxy ketones; 4. Evaluation of a suitable cofactor regeneration system (substrate-coupled and enzyme-coupled approach) for the enzymatic 2-step synthesis, where smart implementation of co-substrates (benzyl alcohol or ethanol) allows in situ removal of the co-product (benzaldehyde or acetaldehyde) from the second cascade step by reusing it in the first catalytic step (carboligation) of the cascade; 5. Reaction engineering of the synthetic multi-enzymatic cascade with assistance of mathematical modelling, to optimise the overall yield of the synthetic cascade. During this work two synthetic recycling cascade reactions using a substrate-coupled and an enzyme-coupled approach for cofactor regeneration were developed. For the substrate-coupled approach benzyl alcohol was used as co-substrate, and the co-product benzaldehyde was reused as a substrate in the carboligation step. For the enzyme-coupled approach ethanol was chosen as a co-substrate and the resulting acetaldehyde was also reused as substrate for the C–C bond formation. Whereas good conversions (> 70%), but moderate stereoselectivities (dr syn/anti 9:1) were obtained for the production of (1R,2R)-1-phenylpropane-1,2-diol in cascade reactions using the substrate-coupled approach, the enzyme-coupled approach yielded excellent conversions (> 95%) and diastereoselectivities (de > 99%). Furthermore, during this thesis the most promising alcohol dehydrogenase from Ralstonia sp. for the reduction of α-hydroxy ketones was subject of crystallisation studies for X-ray structural investigations in order to explain its high potential for conversion of especially bulky substrates. Alkoholdehydrogenasen sind für die stereoselektive Synthese von Molekülen mit mehreren chiralen Zentren von großer Bedeutung. Sie können entweder für einzelne enzymatische Reduktions- bzw. Oxidationsschritte oder als Teil von synthetischen enzymatischen mehrstufigen Kaskaden für die Produktion von industriell relevanten chiralen Synthesebausteinen verwendet werden. Obwohl Biotransformationen mit Alkoholdehydrogenasen weit verbreitet sind, sind Enzyme, die sterisch anspruchsvolle Substrate, insbesondere α-Hydroxyketone, akzeptieren, in der Natur selten. Daher sind chemische Verfahren für die Synthese von chiralen 1,2-Diolen bisher die erste Wahl. Ein Nachteil der Verwendung von Alkoholdehydrogenasen sind teure Nicotin-amidcofaktoren wie NAD(H) oder NADP(H), die für die Katalyse benötigt werden. Die hohen Preise dieser Cofaktoren verhindern ihren Einsatz in stöchiometrischen Mengen. Aus diesem Grund ist die Regeneration von Nicotinamidcofaktoren ein wichtiges Thema für biotechnologische Anwendungen. Dazu wird ein Cosubstrat verwendet, das während der enzymatischen Cofaktorregenerierung in äquimolaren Mengen, relativ zum Produkt; zum entsprechenden Coprodukts umgesetzt wird. Dieses Coprodukt muss vom Produkt abgetrennt oder in situ entfernt werden. Dies verringert sowohl die Atomökonomie als auch die Wirtschaftlichkeit des Prozesses. In dieser Arbeit wird die Carboligation von zwei kostengünstigen Aldehyden durch Thiamindiphosphat-abhängige Enzyme katalysiert und mit einer anschließenden Reduktion des intermediär gebildeten α-Hydroxyketons zum 1,2-Diol durch Alkoholdehydrogenasen kombiniert. Dafür musste eine geeignete Cofaktor¬regenerierung mit in situ Coproduktentfernung entwickelt werden, um eine hohe Ökoeffizienz der synthetischen Enzymkaskade sicherzustellen. Um dieses Ziel zu erreichen, wurden folgende Arbeitspakete behandelt: 1. Untersuchung des Substratspektrums von acht verfügbaren Alkohol-dehydrogenasen mit Fokus auf die Reduzierung sterisch anspruchsvoller α-Hydroxyketone; 2. Bestimmung der Stereoselektivität der ersten und der zweiten Stufe der synthetischen Kaskade; 3. Auswahl des vielversprechendsten Enzyms für die Reduktion von α-Hydroxyketonen (hier die Alkoholdehydrogenase aus Ralstonia sp.) und seine detaillierte biochemische Charakterisierung mit Fokus auf die Reduktion von α-Hydroxyketonen; 4. Evaluierung eines geeigneten Cofaktorregenerationssystems (Substrat-gekoppelter und Enzym-gekoppelter Ansatz) zur enzymatischen 2-Schritt-Synthese, wobei die intelligente Wahl der Cosubstrate (Benzylalkohol bzw. Ethanol) eine in situ-Entfernung der gebildeten Coprodukte (Benzaldehyd bzw. Ethanol) des zweiten Kaskadenschritts durch dessen Wieder-verwendung in der ersten katalytischen Stufe der Kaskade (Carboligation) ermöglicht; 5. Reaktionstechnische Optimierung der synthetischen multi-enzymatischen Kaskade mit Hilfe mathematischer Modellierung zur Optimierung der Ausbeute der gesamten Kaskade. Während dieser Arbeit wurden zwei synthetische Recycling-Kaskadenreaktionen mit einem Substrat-gekoppelten und einem Enzym-gekoppelten Ansatz für die Cofaktorregenerierung entwickelt. Für den Substrat-gekoppelten Ansatz wurde Benzylalkohol als Cosubstrat verwendet und das entstehende Nebenprodukt Benzaldehyd als Substrat in dem Carboligationsschritt wiederverwendet. Bei dem Enzym-gekoppelten Ansatz mit Ethanol als Cosubstrat wurde das resultierende Acetaldehyd ebenfalls als Substrat für die C-C-Verknüpfung wiederverwendet. Während gute Umsätze (> 70%), jedoch begleitet von mäßiger Stereoselektivität (dr syn/anti 9:1), für die Herstellung des (1R,2R)-1-Phenylpropan-1,2-diols in der Kaskadenreaktionen unter Verwendung der Substrat-gekoppelten Ansatzes erzielt wurden, ergab der Enzym-gekoppelte Ansatz ausgezeichnete Umsätze (> 95%) und Diastereoselektivität (de > 99%). Des Weiteren wurden während dieser Arbeit für die, bezüglich der Reduktion von α-Hydroxyketonen, vielversprechendste Alkoholdehydrogenase aus Ralstonia sp. Kristallisationsstudien für die Röntgenstrukturanalyse durchgeführt, um das hohe Potenzial zur Umwandlung von insbesondere sterisch anspruchsvollen Substraten zu erklären.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät
Dokument erstellt am:	13.02.2014
Dateien geändert am:	13.02.2014
Promotionsantrag am:	04.06.2013
Datum der Promotion:	19.07.2013