Dokument: Conformational Dynamics of Calmodulin and Ribosome-Nascent Chain Complexes Studied by Time-Resolved Fluorescence Anisotropy

Titel:	Conformational Dynamics of Calmodulin and Ribosome-Nascent Chain Complexes Studied by Time-Resolved Fluorescence Anisotropy
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=27366
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20131023-100311-2
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Herr Dipl.-Biol. Lamprou, Paraskevas [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 9,51 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 16.10.2013 / geändert 16.10.2013
Beitragende:	Prof. Dr. Fitter, Jörg [Gutachter] Prof. Dr. Willbold, Dieter [Gutachter]
Stichwörter:	co-translation protein folding, fluorescence anisotropy decay, multi-domain protein, nascent polypeptide chain, cell free protein biosynthesis
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	In the presented work, we developed a fluorescence spectroscopy method to study folding of ribosome-bound nascent polypeptide chains. We have chosen Calmodulin (CaM) as a protein model because it is a small protein comprising α-helical structure. To follow the folding, we used a biarsenical ligand (Fluorescein Arsenical Helix Binder or FlAsH), which binds rigidly to a tetra-Cys motif. Such a motif was introduced into the N-terminal sequence of CaM. If a dye (FlAsH) is rigidly bound to its target, this will influence the anisotropy of the fluorescence, as the average angular displacement of a fluorophore, which occurs between absorption and fluorescence emission, reflects the mobility of the molecule. The idea is that if we have a dye probe that can be rigidly attached to a protein, its rotational freedom will report for local dynamics and overall tumbling motion of the protein, as well. Measurements on apo-CaM and CaM-Ca2+ were performed. A considerable increase in the rotational correlation time of CaM upon Ca2+ binding was observed. This shows that when Ca2+ is bound to the molecule, the tertiary structure changes and it becomes more stretched. In a next step, ribosome-nascent chain complexes (RNCs) with the first EF-hand, the half and the full length CaM protruding out of the ribosomal tunnel were studied. The obtained result showed a tendency in the correlation times that were consistent with respect to the size of nascent chains. Another remarkable observation is that it was possible to detect the release of the protein from the ribosome after treatment with puromycin (Puro). Further analysis by circular dichroism measurements showed that CaM started adopting native-like conformation only when the full length nascent chain was emerging from the ribosome. Finally, we got evidence that rigid binding of a dye to a protein provides an advantage over the single covalent bond attachment. Taking everything into consideration, we made some first steps in understanding the co-translational folding process by time-resolved fluorescence anisotropy measurements. In der vorliegenden Arbeit haben wir versucht eine fluoreszenzspektroskopische Methode zur Untersuchung der Faltung von Ribosom-gebundenen naszierenden Polypeptidketten zu entwickeln. Wir wählten Calmodulin (CaM) als Modellprotein, da es ein kleines, aus alpha-Helices bestehendes Protein ist. Um den Faltungsweg zu studieren, entschieden wir einen bi-arsenischen Liganden (Fluorescein Arsenical Helix Binder oder FlAsH) zu benutzen, der rigide an ein tetra-Cystein Motiv bindet. Solch ein Motiv wurde in die N-terminale Sequenz des CaM integriert. Die starre Bindung eines Farbstoffs (FlAsH) an ein Zielmolekül beeinflusst seine Fluoreszenzanisotropie, da der durchschnittliche Winkelversatz des Fluorophores zwischen Absorption und Fluoreszenzemission nicht mehr seine eigene, sondern die Rotationsmobilität des Zielmoleküls widerspiegelt. Die Idee dabei ist, dass der Grad an Rotationsfreiheit des rigide gebundenen Farbstoffs Aufschluss geben kann über die lokale Dynamik sowie die Gesamtrotation des Proteins. Zuerst führten wir Messungen des gereinigten Apo-CaM durch. Diese ergaben die Existenz einer Rotationbewegung, deren Rotationskorrelationszeit nah am Erwartungswert lag. Anschließend untersuchten wir CaM-Ca²+ und ermittelten eine größere Rotationskorrelationszeit. Dieses Ergebnis entsprach unserer Annahme, denn CaM adaptiert eine geordnetere und ausgedehntere Konformation unter Bindung von Ca2+. Unser nächster Schritt waren Messungen von Komplexen aus Ribosomen und gelabelten naszierenden Ketten (RNCs) unterschiedlicher Länge, nämlich der ersten EF-Hand und der Polypeptidketten von halber und ganzer Länge. Die ermittelten Resultate zeigten die erwartete Tendenz in den Korrelationszeiten: je länger die naszierende Kette desto größer die Rotationskorrelationszeit. Eine andere bemerkenswerte Beobachtung war, dass wir nach Zugabe von Puromycin die Freisetzung des Proteins vom Ribosom beobachten konnten. Weitere Analysen indizierten, dass CaM anfängt nur dann seine native Konformation zu adaptieren, wenn die Polypeptidkette der vollen Länge aus dem Ribosom heraustritt. Abschließend erhielten wir den Beweis, dass die rigide kovalente Befestigung eines Fluorophores an ein Protein Vorteile bietet im Vergleich zu flexibleren kovalenten Einfachbindungen. In Anbetracht all dessen haben wir mittels zeitaufgelöster Fluoreszenz-Anisotropie Messungen einige erste Erkenntnisse bezüglich der Konformationsdynamik eines Proteins sowie co-translationaler Faltungsprozesse erhalten.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie
Dokument erstellt am:	23.10.2013
Dateien geändert am:	23.10.2013
Promotionsantrag am:	28.06.2013
Datum der Promotion:	15.10.2013