Dokument: Structural transitions and fibril formation of the prion protein in vitro

Titel:	Structural transitions and fibril formation of the prion protein in vitro
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=2720
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20040127-000720-8
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Leffers, Karl-Werner [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 4,52 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 09.02.2007 / geändert 09.02.2007
Beitragende:	Prof. Dr. Riesner, Detlev [Gutachter] Prof. Dr. Hegemann, J. H. [Gutachter] Prof. Dr. Wille, Holger [Gutachter]
Stichwörter:	Prion, Fibrille, PrP, in vitro, SDS, Infektiosität, Sekundärstruktur, Aggregat, Umfaltung, Konversion
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Prionen sind die Erreger einer neurodegenerativen Erkrankung, die Prionkrankheit genannt wird und sowohl Tiere als auch Menschen befällt. Bisher sind alle Versuche, die ?protein-only?-Hypothese durch de novo Generierung von Infektiosität in vitro zu beweisen, fehlgeschlagen. Ziel dieser Versuche war, die strukturelle Umfaltung des normalen, nicht infektiösen PrPC in das abnormale, infektiöse PrPSc in vitro zu induzieren. Im Rahmen dieser Arbeit sollte ein in vitro-Konversionssystem entwickelt werden, dass die Induktion der beschriebenen strukturellen Umfaltung erlaubt, gefolgt von einer spezifischen Aggregation. Dies sollte zur Bildung amyloider Fibrillen führen wie sie manchmal in Kontext mit Prionkrankheiten gefunden werden. Außerdem sollten die neu entstandenen Strukturen auf Scrapie-typische Marker wie z.B. PK-Resistenz und Infektiosität hin untersucht werden. Um diese Ziele zu erreichen wurde zunächst der Umfaltungsprozess von PrPC-ähnlichen zu PrPSc-ähnlichen Isoformen mit Hilfe eines SDS-abhängigen in vitro-Konversionssystems weitergehend analysiert. Es konnte bestätigt werden, dass PrP bei mittleren SDS-Konzentrationen in eine lösliche ?-Struktur überführt werden kann. Dieses zu Aggregation neigende Intermediat wurde dann in vitro inkubiert unter Bedingungen, die der in vivo-Situation nahe kommen: Neutraler pH, 250 mM Natriumchlorid und eine längere Inkubation bei 37 °C. Des Weiteren wurde der Effekt von Lipiden, die in prion rods gefunden wurden, analysiert. Die Experimente zeigten, dass unter den beschriebenen Bedingungen und ausgehend von löslichem, ?-strukturiertem PrP eine langsame und zum Teil geordnete Aggregation induziert werden kann, d.h. es entstanden u.a. amyloide Fibrillen. Die Gegenwart von Sphingomyelin, Galaktosylcerebrosid und Cholesterol verstärkt die Bildung amyloider Fibrillen, ist aber nicht nötig, um die Bildung der Fibrillen zu induzieren. Es konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass natürliches Volllängen-PrPC aus dem Hirn nicht infizierter Hamster amyloide Fibrillen bilden kann, wie man sie auch in Assoziation mit Prionkrankheiten finden kann. Dennoch zeigten diese in vitro generierten Fibrillen weder die Scrapie-typische PK-Resistenz noch signifikante Infektiosität nach einer Inkubationszeit von ~420 Tagen. Das etablierte SDS-abhängige in vitro-Konversionssystem erlaubt nun das Sammeln weiterer, detaillierter Informationen bezüglich des Umfaltungsprozesses von PrP samt folgender Aggregation: Einige Intermediate des Systems können stabilisiert und weitergehend analysiert werden. Des Weiteren kann der Effekt von anderen sekundären Komponenten analysiert werden. Dies könnte helfen die fehlende Verbindung zwischen Strukturbildung und Infektiosität bei Prionkrankheiten zu finden. Prions are the causative agent of neurodegenerative diseases affecting animals and humans. To date all attempts to prove the ?protein-only? hypothesis by de novo generation of infectivity in vitro have failed. The main aim of these attempts was to mimic the structural transition from the normal, non-infectious PrPC to the abnormal, infectious PrPSc in vitro. This study focused on designing an in vitro conversion system that would allow induction of the described transition process followed by specific aggregation resulting in amyloid fibrils as sometimes found in association with prion diseases. Furthermore, the resulting structures were analyzed for scrapie-related markers, i.e. resistance to digestion with proteinase K and infectivity as measured in bioassays. In order to reach these aims, the transition process from PrPC-like to PrPSc-like isoforms was further analyzed using an SDS-dependent in vitro conversion system. It could be confirmed that PrP can be converted to a soluble ?-structure at intermediate SDS-concentrations. This aggregation prone intermediate was then incubated in vitro at conditions close to the in vivo situation using neutral pH, close to physiological concentrations of sodium chloride and a temperature of 37 °C for several weeks. Additionally, the effect of lipids - as found in prion rods - was analyzed. The experiments revealed that starting from soluble, ?-structured PrP a slow and to some degree specific aggregation, i.e. formation of amyloid fibrils, could be induced. The presence of sphingomyelin, galactosyl cerebroside and cholesterol enhanced fibril formation, but was not necessary to induce it. It could be shown for the first time that native, full length PrPC from brains of uninfected hamsters can form amyloid fibrils similar to those found in association with prion diseases. However, the in vitro generated fibrils showed neither the scrapie-related PK-resistance nor significant infectivity after incubation of ~420 days. The SDS-dependent in vitro conversion system allowed the collection of detailed information on the structural transition and subsequent aggregation process of PrP: Various intermediate stages of these processes can be stabilized and analyzed in greater detail, moreover the effect of various other secondary components can be investigated which may help to finally find the missing link between structure formation and generation of infectivity in prion diseases.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie
Dokument erstellt am:	27.01.2004
Dateien geändert am:	12.02.2007
Promotionsantrag am:	23.01.2004
Datum der Promotion:	23.01.2004