| Beschreibungen: | Since the early 20th century, microbes have written a success story as hosts for the production of various small molecules. Traditional approaches for strain development or analysis are, however, typically based on bulk measurements, which do not interface with high-throughput technologies and provide average data for the whole population. Current efforts in the field of biotechnology aim at the development of novel techniques enabling the detection and quantification of metabolites in single microbial cells. In the present work, a genetically-encoded single cell biosensor was developed, which enables the detection of L-methionine and the branched-chain amino acids in the industrial amino acid producer Corynebacterium glutamicum. The principal design of the biosensor is based on the native Lrp-BrnFE module of C. glutamicum. In response to cytosolic accumulation of L-methionine and the branched-chain amino acids, the transcriptional regulator Lrp was shown to activate expression of the brnFE operon, encoding the transport system for these amino acids. For the construction of the biosensor, a sensor module including lrp, the intergenic region of lrp and brnF, and a transcriptional fusion of brnF to the reporter gene eyfp was designed. Characterization of the biosensor performance features revealed the highest sensitivity of the Lrp-sensor towards L-methionine followed by L-leucine, L-isoleucine, and L-valine. In the case of L-methionine, the minimal linear range of detection extended from <1 mM up to 25 mM (>78-fold dynamic range) and, thus, covered a range, which is relevant to the development of production strains. In the following, the biosensor was implemented in FACS-(fluorescence-activated cell sorting) based high-throughput screenings of C. glutamicum mutant libraries for the isolation of amino acid producing strains. A secondary uHPLC screen for the measurement of amino acid levels in the supernatant of isolated strains revealed about 20% positive clones producing branched-chain amino acids. Further screening attempts, aiming in particular at the isolation of L-methionine producing mutants, emphasized the strong impact of the strain background, medium composition, and FACS gating strategy on the screening outcome. For example, screening of mutagenized C. glutamicum ΔmcbR, lacking the master regulator of L-methionine and L-cysteine synthesis, resulted in about 50% positive clones, which exhibited at least a 100% improvement in L-methionine production in comparison to the parental strain (up to 8 mM). Whole genome sequencing of selected mutants revealed mutations in genes contributing to L-methionine biosynthesis as well as in pathways supplying building blocks, precursors (C1- and sulfur metabolism), redox power (pentose phosphate pathway), and transcriptional regulators involved in the control of sulfur utilization (SsuR and CysR). In further studies the Lrp-sensor was successfully applied for online monitoring of L-valine production strains based on pyruvate dehydrogenase-deficient C. glutamicum strain ΔaceE and was shown to provide information with respect to production start and course of metabolite production over time. Furthermore, the sensor was suitable to reveal different levels of productivity in basic as well as in high yield production strains. In order to investigate the phenotypic structure of L-valine production strains, isogenic microcolonies of C. glutamicum strains were grown under constant environmental cultivation conditions in microfluidic chip devices. The studies displayed cell-to-cell variation with respect to cell size, doubling time, and metabolite production, which significantly depends on the particular growth conditions. Altogether, the obtained results emphasize suchlike sensor systems as convenient and valuable tool for strain development and single cell analysis and reveal versatile applications for future studies.Seit Beginn des 20. Jahrhunderts werden Mikroben erfolgreich zur Produktion von verschiedenen Molekülen eingesetzt. Traditionelle Methoden in der Stammentwicklung oder Analyse basieren jedoch auf Messungen, welche nicht mit Hochdurchsatz-Technologien kompatibel sind und lediglich Durchschnittswerte der gesamten Population liefern. Gegenwärtige Bemühungen auf dem Feld der Biotechnologie verfolgen die Entwicklung von neuen Technologien, welche die Detektion und Quantifizierung von Metaboliten auf Einzelzellebene ermöglichen. In der vorliegenden Arbeit wurde ein genetisch-kodierter Biosensor entwickelt, welcher die Detektion von L-Methionin und den verzweigtkettigen Aminosäuren in dem industriell eingesetzten Aminosäure-Produzenten Corynebacterium glutamicum ermöglicht. Das Design des Biosensors beruht auf dem nativen Lrp-BrnFE Modul aus C. glutamicum. Bei intrazellulärer Akkumulation von L-Methionin oder den verzweigtkettigen Aminosäuren aktiviert der Transkriptionsregulator Lrp die Expression der brnFE Gene, welche für das Transportsystem für die zuvor genannten Aminosäuren kodieren. Zur Konstruktion des Biosensors wurde ein Modul gebaut, welches lrp, die intergene Region zwischen lrp und brnFE sowie eine transkriptionelle Fusion von brnFE mit dem Reportergen eyfp umfasst. In Charakterisierungsstudien zeigte der Lrp-Biosensor die höchste Affinität gegenüber L-Methionin gefolgt von L-Leucin, L-Isoleucin und L-Valin. Hierbei reichte der minimale Bereich zur linearen Detektion von L-Methionin von <1 mM bis 25 mM (>78-facher dynamischer Messbereich), welcher somit den Messbereich abdeckte, der für die Entwicklung von Produktionsstämmen relevant ist. Im Folgenden wurde der Biosensor in FACS-(fluorescence-activated cell sorting) basierten Hochdurchsatz Screenings von C. glutamicum Mutanten-Bibliotheken zur Isolation von Aminosäure-produzierenden Stämmen eingesetzt. Ein zweites uHPLC Screening zur Messung der Aminosäurekonzentration im Überstand der isolierten Stämme, ergab 20% positive Klone, welche eine Produktion der verzweigtkettigen Aminosäuren zeigten. Weitere Screening Versuche, welche insbesondere die Isolation von L-Methionin produzierenden Mutanten verfolgten, stellten heraus wie stark der Ausgangsstamm, die Medienzusammensetzung und die FACS gating Strategie das Screening Resultat beeinflussen. So resultierte zum Beispiel das Screening ausgehend von einer C. glutamicum ΔmcbR Mutanten-Bibliothek in 50% positiven Mutanten, die mindestens eine um 100% gesteigerte L-Methionin Produktion im Vergleich zum Ausgangsstamm zeigten. Die Sequenzierung des vollständigen Genoms dieser Mutanten offenbarte Mutationen in Genen, welche in der Biosynthese von L-Methionin involviert sind, sowie in Genen der Stoffwechselwege zur Bereitstellung von Ausgangssubstraten und Vorläufermolekülen (C1- und Schwefelmetabolismus) oder Reduktionsenergie (Pentosephosphatweg). Zudem konnten auch Mutationen in Genen identifiziert werden, die für die Transkriptionsregulatoren des Schwefelstoffwechsels, CysR und SsuR, kodieren. In weiteren Studien wurde der Lrp-Sensor erfolgreich zum Online Monitoring in L-Valin Produktionsstämmen eingesetzt, bei welchen er Information über den Produktionsstart sowie über den zeitlichen Verlauf der Produktion lieferte. Desweiteren eignete sich der Sensor dazu verschiedene Produktionslevel in einfachen und leistungsstarken Produktionsstämmen aufzuzeigen. Um die komplexe Populationsstruktur von L-Valin Produktionsstämmen näher zu untersuchen, wurden weitere Versuche in Mikrofluidik-Vorrichtungen durchgeführt, welche konstante Kultvierungsbedingungen bieten. Diese Untersuchungen zeigten Heterogenitäten auf Einzelzellebene in Bezug auf die Zellgröße, Verdopplungszeit sowie die Metabolitproduktion, welche sehr stark von den Kultivierungsbedingungen abhängig waren. Zusammenfassend stellen diese Arbeiten Biosensoren als geeignetes und nützliches Werkzeug zur Einzelzell-Analyse und Stammentwicklung heraus und zeigen deren vielseitige Applikationen für künftige Studien.
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