Dokument: Analytical studies on the kavain metabolism in human specimens and liver cell lines
| Titel: | Analytical studies on the kavain metabolism in human specimens and liver cell lines | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=2703 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20040115-000703-9 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Englisch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Tarbah, Fuad Ali [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Daldrup, Thomas [Gutachter] Prof. Dr. Willuhn, G. [Gutachter] Prof. Dr. Weber, Horst [Gutachter] | |||||||
| Stichwörter: | Kavain, Metabolismus, Hep-G2 Cell, Human, Blut, Urin, GC/MS, HPLC-DAD, LC-MS/MS,Kavain, Metabilism, Hep-G2 Cell, Human, Blood, Urine, GC/MS, HPLC-DAD, LC-MS/MS | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften » 610 Medizin und Gesundheit | |||||||
| Beschreibungen: | ?Kawa-Kawa? ist ein aus der Wurzel von Piper methysticum G. Forster hergestelltes, auf den Südseeinseln lange bekanntes und weit verbreitetes, berauschend wirkendes Getränk. Für die Wirksamkeit der Kava-Droge werden bestimmte Inhaltsstoffe von Piper methysticum, die sogenannten Kavapyrone (Kavalactone), verantwortlich gemacht. Mit ca. 5 bis 12 % Anteil ist Kavain eines der Haupt-Kavalactone. Kavain soll, ähnlich wie die Benzodiazepine, einen allosterischen Effekt auf den GABAA-Rezeptor haben, wodurch seine anxiolytische und antidepressive Wirkung erklärt wird. Da seine zentralen Wirkungen grundsätzlich zu einem Missbrauch führen können, wird es auch für Fragestellungen aus der forensischen Toxikologie interessant. Ziel dieser Arbeit war es daher, geeignete Verfahren zum Nachweis und zur Identifikation von Kavain und seinen Metaboliten zu entwickeln und auf dieser Basis neue Erkenntnisse zum Metabolismus und zur Pharmakokinetik von Kavain zu erlangen. Die Literatur gibt hierzu nur sehr unvollständig Auskunft. In einer in-vitro-Studie wurde modellmäßig zuerst der Metabolismus von Kavain in Hep-G2-Zellen untersucht. Nach Extraktion (Flüssig-Flüssig-Extraktion und SPE) wurden Kavain und seine Metaboliten mittels GC/MS (MSD HP 5970 (70 eV), GC HP 58790, Säule: HP-5 (i.D. 0,25 mm, 30 m); Linearität für Kavain (K) im Bereich von 20 bis 5000 ng/mL (hierfür teilweise derivatisiert) und HPLC/DAD Waters Alliance mit PDA 996, Acetonitril (31 % w/w) mit Phosphatpuffer pH = 2,3, Flow 1,0 mL/min isokratisch, Säule: LiChrospher 60 RP select B; Linearität für Kavain (K) von 5 bis 100 ng/mL) sowie in einigen Fällen mit LC/MS identifiziert und charakterisiert. Um die Eignung der angewendeten Methoden sicherzustellen, wurden Nachweisgrenzen, Linearitätsbereiche und Variationskoeffizienten bestimmt (GC/MS: für Kavain (K), 12-Hydroxykavain (III), 12-Hydroxy-7,8-dihydrokavain (V) und 12-Hydroxy-5,6-dehydrokavain (IX); HPLC: für Kavain (K) und 12-Hydroxykavain (III)). Für die Quantifizierung erwies sich die HPLC mit DAD als besonders geeignet. Hierfür wurden auch Präzision, Reproduzierbarkeit und Wiederfindung bestimmt. Aus den Zellkulturen wurden nach Inkubation mit Kavain unverändertes Kavain sowie 14 Metaboliten extrahiert. Von 12 dieser Metaboliten ist bereits bekannt, dass sie mit dem Urin ausgeschieden werden (Mensch, Ratte). 4-Oxy-cinnamyl-aceton (XIII) und der bisher unbekannte Metabolit XVIII wurden erstmals in Hepatozellen nachgewiesen. Bei späteren Untersuchungen zeigte sich, dass XIII ausschließlich in den Leberzellkulturen aufzufinden war. In den Leberzellen nachgewiesene Stoffwechselwege sind danach a) Hydroxylierung (zu I, III, IV, V und zu den 7,8-Dihydroderivaten IV und V) und schließlich Glucuronidierung (IV), b) Dehydrierung (zu VI und nach Hydroxylierung ? s.o. - zu XVIII) sowie c) Öffnung des Lactonringes und Oxidation an der Seitenkette (X, XI, XIII, XIV, XV und XIX). Nach Spaltung mit ß-Glucuronidase ist ein deutlicher Anstieg von IV festzustellen, das nach den MS- und UV-Daten sehr wahrscheinlich mit 11-Hydroxy-7,8-dihydrokavain identisch ist. Konkrete Hinweise auf toxische Effekte konnten auch bei Einsatz hoher Kavain-Mengen (bis 60 mg/ 200 mL Kulturmedium) und Inkubationszeiten bis zu 70 Stunden nicht beobachtet werden. Daher wurden die Metabolismusuntersuchungen im Selbstversuch fortgesetzt. In vier Versuchsreihen wurden vor und nach oraler Einnahme von 200 oder 800 mg D,L-Kavain Blut und Urin abgenommen und untersucht. Unverändertes Kavain war im Urin nicht nachweisbar. Die in Blut und Serum aufgefundenen Kavain-Konzentrationen waren im Vergleich zur applizierten Dosis sehr niedrig (10 bis 40 ng/mL, nachweisbar 30 min. bis ca. 4 Stunden nach Kavaineinnahme). Kavain wird offensichtlich sehr schnell über den First Pass-Effekt metabolisiert. Unter den möglichen Stoffwechselwegen spielt die Hydroxylierung an der C-12-Position des Phenylrings und damit die Bildung von 12-Hydroxykavain (III) eine Hauptrolle. Die Versuche ergaben, dass die maximale Konzentration von III im Blut nach 45 Minuten erreicht wird. Im Serum lagen 50 % von III als Glucuronid, 12 % als Sulfat und 38 % in freier Form vor (Verhältnis Serum zu Blut ca. 2:1). Im Urin wurden nur 1,4 % III in freier Form ausgeschieden (maximale Konzentrationen nach 2 Stunden). 15,3 % waren glucuronidiert, und 83,3 % lagen als Sulfat vor. Erstmals konnte gezeigt werden, dass Hydroxykavain (I) einen wichtigen, im Blut nachweisbaren Metaboliten darstellt. Im Blut wurde es nach oraler Gabe von 800 mg Kavain in Konzentrationen von 30 bis 50 ng/mL nachgewiesen. Das Maximum wurde nach 2,5 Stunden erreicht. Durch enzymatische Spaltung wurde gezeigt, dass dieser Metabolit nicht glucuronidiert oder sulfatiert vorliegt. 5,6-Dehydrokavain (VI) wird durch Desmethylierung in C-4-Position des Lactonringes weiter zu dem unbekannten Metabolit XVIII metabolisiert. XVIII wurde im Serum in Konzentrationen zwischen 38 und 84 ng/mL aufgefunden, die maximalen Konzentrationen wurden nach 2 Stunden beobachtet. Im Urin war XVIII auch noch nach 24 Stunden nachweisbar. Durch enzymatische Spaltung wurde gezeigt, dass auch dieser Metabolit teilweise glucuronidiert bzw. sulfatiert vorliegt. Im Urin, jedoch nicht im Blut bzw. Serum, konnte weiterhin als Vertreter der 7,8-Dihydro-Derivate 12-Hydroxy-7,8-dihydrokavain (V) nachgewiesen werden. Bemerkenswert ist, dass dieser Metabolit erst 5 Stunden nach der oralen Aufnahme und ausschließlich in konjugierter Form (Glucuronid : Sulfat = 2 : 1) über den Urin eliminiert wird. Auch der letzte bei dem Leberzellenversuch nachgewiesene Abbauweg (Öffnung des Lactonringes) konnte gefunden werden. Im Urin wurde der Metabolit 6-Phenyl-5-hexen-2,4-dion (XV) sowohl mit GC/MS als auch mit LC/MS nachgewiesen. Für den Hauptmetaboliten 12-Hydroxykavain (III) und seine Konjugate (Glucuronid, Sulfat) wurden zusätzlich kinetische Parameter (Geschwindigkeitskonstante, Plasmaeliminations-Halbwertszeit, AUC, Verteilungsvolumen sowie renale Clearance) bestimmt. Mit den hier vorgestellten Ergebnissen haben sich für die Kava-Forschung, die insbesondere zur Hepatotoxizität von Kavalactonen noch Fragen beantworten muss, wichtige neue Erkenntnisse hinsichtlich des Kavain-Metabolismus ergeben. Die Abbauwege von Kavain erwiesen sich als aus dem in-vitro-Modell auf den Menschen übertragbar und wurden über die Metaboliten abgesichert. Die zur Identifizierung und zur Quantifizierung von Kavain und seinen Metaboliten eingesetzten Methoden haben sich zudem als validierbar erwiesen und entsprechen damit den Erfordernissen der forensischen Toxikologie. Bei forensischen und verkehrsmedizinischen Fragestellungen muss der Nachweis von Kavain und damit einer auf dem Gebrauch der Kava-Droge basierenden Wirkung in Körperflüssigkeiten und Organen geführt werden können. Nach unseren Erfahrungen besteht in den Ländern, in denen der Kava-Konsum verbreitet ist, ein großes Interesse an solchen Methoden. Teilaspekte des Kavain-Metabolismus sind damit geklärt, es werden aber auch weiterhin noch Forschungsanstrengungen notwendig sein, um Pharmakokinetik und ?dynamik der Kava-Wirkstoffe vollständig zu verstehen.?Kava-Kava? is an intoxicating beverage made from the roots of Piper methysticum G. Forst. It is a widespread and since a long time well known drink on the islands of the South Pacific. For the effect of the kava drug certain ingredients of Piper methysticum, the so called kava-pyrones (kava-lactones), are made responsible. Kavain is one of the main kava-lactones representing about 5 to 12 % of the total amount of kava-lactones. Kavain is supposed to have similar to benzodiazepines an allosteric influence on the GABAA receptor-complex, through which the anxiolytic and antidepressant effect is explained. The fact that its central effects can generally lead to abuse, makes kavain an interesting subject for questions from the field of forensic toxicology. Thus the aim of this study was to develop suitable methods to detect and identify kavain and its metabolites and on this basis to gain new knowledge regarding the metabolism and pharmacokinetics of kavain. The available information from the literature on this topic is very incomplete. In an in-vitro study the kavain metabolism was first exemplary examined in Hep-G2 cells. After extraction (fluid-fluid extraction and SPE), kavain and its metabolites were identified and characterised by GC/MS (MSD HP 5970 (70 eV), GC HP 58790, column: HP-5 (i.D. 0,25 mm, 30 m); linearity for kavain (K) ranged between 20 to 5000 ng/ml (partly derivatised) and HPLC-DAD Waters Alliance with PDA 996, acetonitrile (31 % w/w) with phosphate-buffer pH = 2,3, flow 1,0 ml/min isocratic, column: LiChrospher 60 RP select B; linearity for kavain (K) from 5 to 100 ng/ml) and in some cases by LC/MS. To verify the suitability of the used methods, limits of detection, linearity and coefficients of variation were determined (GC/MS: for kavain (K), 12-hydroxykavain (III), 12-hydroxy-7,8-dihydrokavain (V) and 12-hydroxy-5,6-dehydrokavain (IX); HPLC-DAD: for kavain (K) and 12-hydroxykavain (III)). For the quantification HPLC-DAD proved to be suitable. For this, precision, reproducibility and repeatability were determined. Unchanged kavain as well as 14 metabolites were extracted from the cell cultures after incubation with kavain. 12 of these metabolites are already known to be excreted via urine (human, rat). 4-Oxy-cinnamyl-acetone (XIII) is exclusively available in liver cell cultures, but not in blood or urine. The detected metabolite pathways in the liver cells are hereafter: a) hydroxylation (to I and III), hydroxylation with reduction of 7,8 double bonds (to give IV and V) and finally glucuronidation and sulfatation, b) dehydrogenation (to VI and after hydroxylation - to give IX and Ixa) and c) opening of the lactone ring, oxidation and decarboxylation at the side chain to give X, XI, XIII, XIV, XV and XIX. After enzymatic cleavage using ß-glucuronidase from E.coli a clear increase of IV is detectable, which is likely to be identical with 11-hydroxy-7,8-dihydrokavain according to the MS- and UV data. Concrete hints regarding toxic effects could not be observed even after usage of high kavain amounts (up to 60 mg/ 200 ml culture media) and incubation times of up to 70 hours. Due to this, the metabolism studies were continued with the help of self-medication experiments. In a series of four experiments blood and urine samples were taken before and after oral uptake of 200 or 800 mg D,L-kavain and analysed. Unchanged kavain could not be detected in urine. The kavain concentrations in blood and serum were very low compared to the administered dose (10 to 40 ng/ml, detectable 30 min. to about 4 hours after kavain uptake). It is obvious that kavain is quickly metabolised via the first pass effect. Of the possible metabolic pathways, the hydroxylation at position C-12- of the phenyl ring and thus the formation of 12-hydroxykavain (III) plays a major part. The experiments revealed that the maximum concentration of III in blood is reached after 45 minutes. In serum 50 % of III were available as glucuronide, 12 % as sulfate, and 38 % in its free form (ratio of serum to blood is about 2:1). In urine only 1.4 % of III were excreted in its free form (maximum concentration after 2 hours). 15.3 % were found as glucuronide, and 83.3 % as sulfate. Another possibility of the phenyl ring hydroxylation was that it has taken place at the non established position of the phenyl ring, this can produce the metabolite hydroxykavain (I). It is an important metabolite which is detected in blood after oral uptake of 800 mg kavain at concentrations of 30 to 50 ng/ml. The maximum was reached after 2.5 hours. It was shown via enzymatic cleavage that this metabolite is not conjugated. Dehydratation at the postion 5,6 of the lactone ring was the metabolism pathway to form 5,6-dehydrokavain (VI) which was detected in urine. It could be further metabolised to the unidentified metabolite (XVIII) by desmethylation at the C-4-position of the lactone ring. XVIII was detected in serum in concentrations between 38 and 84 ng/ml. The maximum concentrations were observed after 2 hours. In urine XVIII was still detectable after 24 hours. It was shown via enzymatic cleavage that this metabolite is partly conjugated as glucuronide or respectively sulfate. In urine, though not in blood or serum, 12-hydroxy-7,8-dihydrokavain (V) could be detected as a representative of the 7,8-dihydro-derivates. It is remarkable that this metabolite is eliminated by the urine just after 5 hours from oral uptake and exclusively in its conjugated form (glucuronide:sulfate = 2:1) The last degradation pathway which was observed in the liver cell experiment could be detected as well, the metabolite 6-phenyl-5-hexene-2,4-dione (XV) was detected in urine by GC/MS as well as LC/MS. For the metabolite 12-hydroxykavain (III) and its conjugates (glucuronide, sulfate) additional kinetic parameters (rate constant of terminal slope, plasma elimination half life, AUC, volume of distribution as well as renal clearance) were determined. The presented results revealed new insights regarding the kavain metabolism. The degradation pathways of kavain proved to be applicable from the in-vitro model to humans by evidence of the metabolites. The methods used for identification and quantification of kavain and its metabolites could be validated and thus comply with the requirements of forensic toxicology. In the field of forensic toxicology and traffic medicine, it was necessary to have a validated method for the determination of kavain and its metabolites in different materials to give an expert opinion in cases of misuse or abuse of this drug. Our experiences show that there is a big interest in such methods in countries with widespread kava consumption. Some aspects of the kavain metabolism are therefore resolved, though further research is necessary to fully comprehend the pharmacokinetics and -dynamics of the kava-lactones. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Medizinische Fakultät | |||||||
| Dokument erstellt am: | 15.01.2004 | |||||||
| Dateien geändert am: | 12.02.2007 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 17.12.2003 | |||||||
| Datum der Promotion: | 17.12.2003 |
