Dokument: Ein Transposon-basiertes Sytstem zur genetischen Transformation der Honigbiene Apis mellifera

Titel:	Ein Transposon-basiertes Sytstem zur genetischen Transformation der Honigbiene Apis mellifera
Weiterer Titel:	A transposon mediated germline transformation system for the honeybee Apis mellifera
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=27009
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20130924-092037-5
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Schulte, Christina [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 3,08 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 24.09.2013 / geändert 24.09.2013
Beitragende:	Prof. Dr. Beye, Martin [Gutachter] Prof. Dr. Lunau, Klaus [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Zusammenfassung Um die Funktionen zu charakterisieren, die Gene in ihrem entwicklungs- oder verhaltensbiologischen Kontext einnehmen, müssen diese Gene in einem Organismus gezielt exprimiert oder ihre Transkription verhindert werden. In der vorliegenden Arbeit wurde eine Methode zur stabilen Gentransformation der Honigbiene Apis mellifera mittels eines piggyBac-basierten Transposons etabliert. Im Zuge dessen wurde eine Methode zur Aufzucht von transgenen Königinnen und deren Nachkommen entwickelt. Dabei wurde die Expressionskassette 6xP3-rubia als effizienter Marker für transformierte Honigbienen eingesetzt und die Transformation mittels PCR, Fluoreszenz des Markerproteins Rubia und Sequenzierung der Integrationsstellen im Genom nachgewiesen. Es konnte gezeigt werden, dass das integrierte Transposon stabil an die nächste Generation weitergegeben wird. Bei der Generierung von transgenen Honigbienen konnte eine Transformationsrate von 26% erzielt werden. Diese Rate ist im Vergleich zu anderen Spezies, die durch ein piggyBac-basiertes Transposon transformiert wurden, bis zu zehnmal höher. Um Gentranskripte innerhalb transgener Tiere zu exprimieren oder abzubauen, werden speziesspezifische Promotoren benötigt. In der vorliegenden Arbeit konnten Promotorkandidaten für konstitutive, temperaturinduzierbare und gehirnspezifische Genexpression in der Honigbiene identifiziert werden. In Sf21-Insektenzellkultur konnte gezeigt werden, dass die Promotorsequenzen der Honigbienengene Am-actin5c, Am-hsp70 und Am-hsp83 die Expression des Reportergens rubia initiieren. Es wurde zudem gezeigt, dass die Expression von rubia unter Kontrolle des Promotors Am-hsp83 durch einen Kälteschock erhöht werden kann. In einem Elektroporationsexperiment konnte weiterhin gezeigt werden, dass der Promotor des Honigbienengens elp2l in lebenden Zellen des Bienengehirns Genexpression initiiert. Abschließend wurde der Promotor Am-actin5c mit dem etablierten Transformationssystem kombiniert und so erste transgene Honigbienen generiert, in denen ein honigbienenspezifischer Promotor die Expression des Reportergens egfp vermittelt. Das etablierte Transformationssystem bietet die Möglichkeit in zukünftigen Experimenten Gene zu identifizieren, die die einzigartigen entwicklungs- und verhaltensbiologischen Eigenschaften der Honigbiene kodieren. Summary The honeybee Apis mellifera displays a rich behavioural repertoire, social organisation, caste differentiation and has an interesting mode of sex determination, but we still know little about the underlying genetic programs. In the present work I established a piggyBac transposon-mediated system to transform the honeybee and a method to raise transgenic honeybee queens and their offspring. I inaugurated the expression cassette 6xP3-rubia as an efficient fluorescent marker for honeybee transgenesis and confirmed the transformation via PCR, Rubia-derived marker fluorescence and by identifying the integration sites of piggyBac in the honeybee genome. I found that the integrated transposon is stable transmitted to the next generation. I achieved a transposition rate of 26 % which is substantially higher than in other species that were transformed with a similar system. The transposition rate displays the proportion of queens with transgenic progeny within all fertile queens. As an initial step towards transgene expression, I characterized honeybee promoters that can drive constitutive, tissue specific and cold shock induced gene expression. I identified the promoter sequences of Am-actin5c, elp2l, Am-hsp83 and Am-hsp70 and showed that, except for the elp2l sequence, the identified sequences were able to direct reportergene expression in Sf21-cells. I showed further that gene expression driven by the Am-hsp83 promoter is increased after shift to a lower temperature. I further demonstrated via electroporation experiments that the putative neuron specific elp2l promoter sequence can direct gene expression in the honeybee brain. The identification of these promoter sequences is an important step towards the study of gene functions with transgenic honeybees. In a final experiment I combined a honeybee specific promoter with the honeybee transformation system and generated first transgenic individuals in which Am-actin5c promoter drives the expression of the reportergene egfp. The established transformation system will enable us to identify genes that encode the fascinating features and behaviours of the honeybee. It will allow further molecular advances in understanding the remarkable biology of this social organism.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Genetik
Dokument erstellt am:	24.09.2013
Dateien geändert am:	24.09.2013
Promotionsantrag am:	31.10.2012
Datum der Promotion:	18.04.2013