Dokument: Experimente zur Generierung einer knockout Maus für Untersuchungen zur Funktion des Plasmodium chabaudi induzierbaren imap38 Gens
| Titel: | Experimente zur Generierung einer knockout Maus für Untersuchungen zur Funktion des Plasmodium chabaudi induzierbaren imap38 Gens | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=2681 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20031217-000681-1 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Englisch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Kolpakova, Anna [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Wunderlich, Frank [Gutachter] Prof. Dr. Mehlhorn, Hans-Peter Heinz [Gutachter] | |||||||
| Stichwörter: | imap38, Plasmodium chabaudi, knockout Maus, ACN cassette, AIG1imap38, Plasmodium chabaudi, knockout Mouse, angiothensine converting enzyme, ACN cassette, AIG1 | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie | |||||||
| Beschreibungen: | Das imap38 Gen wurde früher in unserem Labor durch differenzielles ?screening? identifiziert und charakterisiert. Imap38 gehört zur Familie der AIG-ähnlichen Proteine, welche in Mäusen, Ratten, Menschen und Pflanzen gefunden wurden. AIG-ähnliche Gene aus Säugetieren sind sehr konservativ in ihrer Struktur. Die Funktionen anderer Gene der Familie sind noch nicht genau bekannt. ian1 nimmt Teil an der Differenzierung der T-Zellen. ian4 spielt auch eine wichtige Rolle während der Apoptose von T-Zellen. Man vermütet, dass imap38 wichtig bei der Heilung von Malaria Infektionen ist. Es wurde gezeigt, dass imap38 während der Malaria Infektion induziert wird und sogar 13 Wochen nach der Infektion auf einem hohem Niveau exprimiert wird. Die Expression des imap38 Gens wurde in der Milz der Maus in Makrophagen und B-Zellen, sehr niedrig in T-Zellen nach der Plasmodium chabaudi Infektion bestimmt. Während P53-vermittelten Apoptose in Kulturen der myeloiden leukämischen Zellinie LTR6 der Maus wurde eine sechsfache Überexpression von imap38 ermittelt. Keine Stimulierung führte zur Induzierung von imap38 in Milzzellen in vitro oder ex vivo. Diese Arbeit wurde durchgeführt um eine imap38-knockout Maus zu generieren, die als ein Werkzeug für Untersuchung der Funktion von imap38 in vivo dient. Die Untersuchung der Funktion von imap38 kann die kenntnisse über Immunantworten gegenüber der Malaria verbessern und dadurch einen Fortschritt in die Antimalariaforschung bringen. Der Mausstamm C57BL/6 wurde als Modell für Knockout ausgewählt, weil er P. chabaudi Malaria überlebt, immun wird und imap38 während der akuten Phase und auch nach der Infektionsheilung auf einem hohen Niveau exprimiert. Imap38 hat eine typische für AIG ähnliche Gene Struktur. Es besteht aus zwei kleinen Exonen und einem dritten großten Exon, die mit 2 bzw. 1 kbp großen Intronen von einander getrennt sind. Der N-terminus des IMAP38 ist in 43 bp vom zweiten Exon kodiert. Es enthält weder Signalsequenzen noch funktionelle Domänen. Die Entfernung des größten Exons, das ein ATP-Bindungsmotiv und eine Transmembranedomäne kodiert, war das Ziel des Targeting. Eine verbesserte, klassische Targeting Strategie wurde realisiert. Eine Cre-vermittelte Rekombination wurde für das Ausschneiden des Resistenzmarkers zusammen mit Cre Rekombinase Genen während Spermatogenese benutzt. Es wurde ein Targeting Vektor (replacement type) konstruiert, der eine selbst-ausschneidende ACN-Kassette enthält. Sieben embryonale Stammzellklone mit einem targeted Allel wurden generiert und in CB20, NMRI, C57BL/6×129sv und c2J Blastozysten injiziert. Es wurden 13 Chimeren gewonnen. Von 241 analysierten Nachkommen der Chimeren hatte keiner ein deletiertes Allel. Mögliche Gründe und Perspektiven werden diskutiert. Die Verwendung der alternativen Methode zur Herstellung einer imap38-knockdown Maus mittels RNAi konnte die gewünschten imap38-defizienten Mäuse generieren.The imap38 gene was identified by differential screening and had previously been characterized in our laboratory. Imap38 belongs to a family of AIG-like proteins, which were found in mice, rats, humans and plants. Mammal AIG-like genes are highly conservative in structure. Functions of other genes in the same family have not yet been studied in detail. ian1 takes place in T-cell differentiation; ian4 plays an important role during apoptosis in T-cells. imap38 is supposed to be important in clearance of malaria infection. It was shown that imap38 is induced during malaria infection and is still expressed at high level even 13 weeks after infection. Expression of imap38 gene was determined in mouse spleen (in macrophages and B-cells, very low in T-cells) after infection with Plasmodium chabaudi. During P53-mediated apoptosis in vitro in a culture of mouse myeloid leukemic cell line LTR6, six-fold overexpression of imap38 was detected. No stimuli led to induction of imap38 in spleen cells in vitro or ex vivo. This work was performed to create an imap38-knockout mouse serving as a tool for in vivo investigation of imap38 function. Investigation of imap38 function can improve knowledge about immune response to malaria and make progress in antimalarial research. Mouse strain C57BL/6 was chosen as background for knockout, because it survives P. chabaudi malaria, becomes immune and expresses high levels of imap38 during the acute phase and after clearance of the infection. Imap38 transcript has a typical AIG-like gene structure consisting of two small exons and a last large exon separated from each other 2 and 1 kbp large introns. N-terminus of IMAP38 is encoded in 43 bp small part of the second exon, contains neither signalling sequences, nor functional domains. Deleting of the largest last exon encoding ATP-binding domain and transmembrane domain was the aim of the targeting, for which an improved classical targeting strategy was realized. Cre-mediated recombination was used to excise the resistance marker together with Cre recombinase gene during spermatogenesis. Targeting replacement type vector containing self-excision ACN cassette was constructed. Seven ES cell clones containing targeting allele were generated and injected in CB20, NMRI, C57BL/6, C57BL/6×129sv and c2J blastocysts. 13 chimeras were obtained. From 241 chimeras? progeny analysed none possessed the deleted or targeted allele. Possible reasons and perspectives are discussed. An alternative approach in generation of imap38 knockdown mice using RNAi might give a desired imap38-deficient mouse. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie | |||||||
| Dokument erstellt am: | 17.12.2003 | |||||||
| Dateien geändert am: | 12.02.2007 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 09.12.2003 | |||||||
| Datum der Promotion: | 09.12.2003 |
