Dokument: Structure and dynamics of a blue-light activated LOV photoreceptor

Titel:	Structure and dynamics of a blue-light activated LOV photoreceptor
Weiterer Titel:	Structure and dynamics of a blue-light activated LOV photoreceptor
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=26759
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20140912-101306-4
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Mrs. Rani, Raj [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 9,67 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 05.09.2013 / geändert 05.09.2013
Beitragende:	Prof. Dr. Jaeger, Karl-Erich [Gutachter] Prof. Dr. Willbold, Dieter [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Light, Oxygen, Voltage (LOV) domains are part of ubiquitously distributed blue-light activated photoreceptors that carry non-covalently bound flavin mononucleotide (FMN) as the light sensitive chromophore to capture photons of the incident radiation. Upon blue-light illumination, LOV domains undergo a spectroscopically but not structurally well characterized photocycle. Based on spectroscopic and X-ray crystallographic data for several plant and bacterial LOV domains, it was suggested that blue-light illumination results in the formation of a covalent bond between a totally conserved cysteine residue and the C4a carbon atom of the flavin isoalloxazine ring. So far little evidence for large-scale light dependent conformational changes associated with photon capture in LOV domains could be provided by X-ray crystallography probably due to the restraint imposed by the presence of the crystal-lattice. On the other hand solution methods such as Nuclear Magnetic Resonance (NMR) and Circular Dichroism (CD) spectroscopy used to study the oat phototropin1-LOV2 domain and other plant LOV domains revealed light dependent conformational changes in the sensor domain which in turn are probably relayed to fused effector domains via the dissociation or unfolding of a C-terminally located α-helical linker-segment (termed Jα-helix). This eventually results in activation of the effector. So far, for bacterial LOV systems, such as the short bacterial LOV proteins Pseudomonas putida studied here, no light dependent loss of helical content or other widespread secondary structural changes have been observed. Here we exemplary use the LOV-proteins PpSB1-LOV and PpSB2-LOV of Pseudomonas putida as a paradigm for an extended LOV-construct. PpSB1-LOV exhibits a plant phototropin LOV-like photochemistry. The protein consists of a conserved LOV core flanked by short N- and C-terminal extensions but lacks a fused effector domain. CD spectroscopy indicates that both LOV-core extensions are helical in similarity to the oat phototropin1-LOV2 construct. However, as for other bacterial LOV proteins, a clear loss of helical content (or any other changes in secondary structure) in response to blue-light illumination has so far not been observed. In order to elucidate the role (and the structure) of the respective extensions, we generated truncated constructs of PpSB1-LOV and PpSB2-LOV. To our surprise, the truncation of both the N- and C-terminal extensions results in a complete loss of solubility of the respective overexpressed protein, indicating that both regions contribute to the proper folding and structural integrity. To investigate the folding of the isolated C-terminal extension the respective polypeptide was synthesized and studied by CD-spectroscopy and 1H-NMR techniques. Both methods suggest that PpSB1-Jα and PpSB2-Jα peptides adopt an α-helical conformation in solution. In order to understand the light-dependent conformational changes in the full-length photoreceptor protein, we used NMR spectroscopy to structurally characterize the dark- and light-state of the protein in solution. After optimization of expression and NMR buffer conditions, we obtained a complete backbone resonance assignment of both the dark- and light-state of PpSB1-LOV. Upon illumination we observe pronounced chemical shift and peak intensity changes for most backbone amide resonances. The data indicate severe light-dependent conformational changes which so far have not been observed for the PpSB1-LOV protein by using other solution techniques. The near complete backbone assignment enabled us to use various types of NMR-based experiments such as H/D exchange and relaxation experiments to characterize the protein dynamics in both states. Those experiments provide valuable insight into the principles of LOV photo-activation, intra-molecular signal relay and signal transduction for this class of bacterial LOV photoreceptors and, at the same time, could guide the structure-based design of LOV based genetically encoded photoswitches. Light, Oxygen, Voltage (LOV) Domänen fungieren als Sensormodule in einer Vielzahl von Blaulicht Photorezeptoren in allen drei Reichen des Lebens (Eukarya, Prokarya und Archaea). Sie binden Flavinmononukleotid (FMN) als lichtsensitiven (absorbierenden) Kofaktor oder Chromophor. Alle bisher beschriebenen LOV Photorezeptoren durchlaufen bei Beleuchtung mit blauem Licht einen spektroskopisch gut, jedoch strukturell unvollständig, verstandenen Photozyklus. Basierend auf spektroskopischen und röntgenkristallographischen Daten konnte gezeigt werden, dass eine Beleuchtung mit Blaulicht zur Ausbildung einer kovalenten Bindung zwischen dem C4a Atom des FMN Chromophores und einem konserviertem Cysteinrest in der LOV Domäne führt (Lichtzustand). Im Dunkeln wird diese Bindung gebrochen, wobei das LOV Protein in seinen Dunkelzustand zurückkehrt. In den entsprechenden Kristallstrukturen konnten jedoch keine größeren, lichtabhängigen Veränderungen nachgewiesen werden. Eine Ursache hierfür könnte in der eingeschränkten Beweglichkeit des Proteinmoleküls zu suchen sein, die durch die Kristallpackung hervorgerufen wird. Im Gegensatz dazu konnte mittels spektroskopischer Verfahren, wie Kernspin-Resonanz- (engl. nuclear magnetic resonance, NMR) und Zirkulardichroismus- (engl. circular dichroism, CD) Spektroskopie gezeigt werden, dass LOV Domänen pflanzlicher LOV Photorezeptoren (Phototropine) bei Beleuchtung in Lösung dezidierte Strukturänderungen durchlaufen. Insbesondere wurde gezeigt, dass die Signalweiterleitung innerhalb des entsprechenden Photorezeptorproteins wahrscheinlich über die Dissoziation und/oder Entfaltung einer α-helix (Jα-helix) am Carboxy-Terminus der LOV Domäne erfolgt. Im Volllängen-Photorezeptor führt dies zur Aktivierung einer fusionierten Serin/Threonin Kinase, welche als sogenannter Effektor oder Signaloutput-Domäne fungiert. Für bakterielle LOV Photorezeptoren konnten bisher keine vergleichbaren Sekundärstrukturänderungen, d.h. insbesondere keine lichtabhängige Entfaltung der Jα-helix, beobachtet werden. In dieser Arbeit wurden exemplarisch zwei bakterielle LOV Proteine, PpSB1 LOV und PpSB2 LOV, aus dem γ-Proteobakterium Pseudomonas putida KT2440 untersucht. Beide Proteine durchlaufen bei Beleuchtung mit blauem Licht einen klassischen LOV Photozyklus. Sie bestehen aus einer konservierten LOV Domäne, welche N- und C-terminal von kurzen Sequenzverlängerungen flankiert wird, besitzen jedoch im Gegensatz zu den meisten anderen LOV Photorezeptoren keine definierte Effektordomäne. CD-spektroskopische Untersuchungen der beiden Volllängenproteine legen nahe, dass die entsprechenden Verlängerungen, analog zur Jα-helix in Phototropin LOV-Domänen, α-helikale Sekundärstrukturen ausbilden. Um die Funktion und Struktur der beiden Verlängerungen zu untersuchen und besser zu verstehen, wurden in dieser Arbeit eine Reihe verkürzter Varianten von PpSB1-LOV und PpSB2-LOV erzeugt. Überraschender Weise führt das Entfernen sowohl der N als auch der C-terminalen Verlängerung dazu, dass die entsprechenden Varianten in E. coli ausschließlich in unlöslicher Form produziert werden. Diese Beobachtung legt nahe, dass die entsprechenden Strukturelemente zur korrekten Faltung und somit zur strukturellen Integrität beider Proteine beitragen. Um die Faltung/Struktur der putativen C terminalen Jα-Helix-Segmente beider Proteine zu validieren, wurden die entsprechenden Polypeptide synthetisiert und mittels CD- und NMR-Spektroskopie untersucht. Beide Methoden zeigen unabhängig voneinander, dass die isolierten Jα-Strukturelemente beider Proteine unterschiedlich lange und unterschiedlich stabile, α-Helices in Lösung ausbilden. Um eine etwaige lichtabhängige Konformationsänderung des PpSB1-LOV Photorezeptors weiter zu untersuchen, wurden in dieser Arbeit NMR-spektrokopische Methoden verwendet. Hierzu wurde das entsprechende Protein sowohl im Dunkelzustand als auch bei Beleuchtung mit blauem Licht in Lösung analysiert. Nach erfolgreicher Optimierung der Expressions-, Reinigungs- und Messbedingungen konnten 99 % der Amidresonanzen des Proteinrückgrates, sowohl im Dunkelzustand als auch bei kontinuierlicher Blaulichtbeleuchtung, in den entsprechenden (1H 15N) heteronuklearen Einquantenkohärenz- (für engl. heteronuclear single quantum coherence, HSQC) Spektren, zugeordnet werden. Der direkte Vergleich der entsprechenden Spektren des Dunkel- und Lichtzustandes deutet auf ausgeprägte Strukturänderungen des Proteins hin, welche bisher mittels anderer biophysikalischer Methoden, wie CD-Spektroskopie, nicht beobachtet werden konnten. Außerdem erlaubte die vollständige Zuordnung der Amidresonanzen des Proteinrückgrates die Durchführung weiterer NMR-basierter Versuche wie H/D Austausch- und Relaxationsexperimente, welche es erlauben, die Dynamik des Proteins in beiden Zuständen zu untersuchen. Die in dieser Arbeit mittels NMR-Spektroskopie erhaltenen Erkenntnisse bieten einerseits einen ersten Einblick in die Mechanismen der Lichtaktivierung und Signalweiterleitung von PpSB1-LOV und verwandter Proteine und könnten in der Zukunft das Design artifizieller LOV-basierter optogenetischer Schalter zur Kontrolle biologischer Prozesse ermöglichen.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät
Dokument erstellt am:	12.09.2014
Dateien geändert am:	12.09.2014
Promotionsantrag am:	11.11.2012
Datum der Promotion:	18.12.2012