Dokument: Koproduktion pharmazeutischer Proteine und Hilfsfaktoren zur Optimierung mikrobieller Expressionssysteme bei Beschränkung auf ein einziges integratives Vektorsystem

Titel:	Koproduktion pharmazeutischer Proteine und Hilfsfaktoren zur Optimierung mikrobieller Expressionssysteme bei Beschränkung auf ein einziges integratives Vektorsystem
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=2672
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20031210-000672-8
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Klabunde, Jens [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 9,03 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 09.02.2007 / geändert 09.02.2007
Beitragende:	Prof. Dr. Hollenberg, Cornelis P. [Gutachter] Prof. Dr. Gellissen, Gerd [Gutachter]
Stichwörter:	Hansenula polymorpha, Arxula adeninivorans, heterologe Genexpression, rDNA Integration, sekretorische Hilfsfaktoren
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibung:	In der vorgelegten Arbeit wird die Etablierung eines Vektorsystems auf Basis der rDNA-Integration beschrieben, womit das Potenzial verschiedener Hefen zur Herstellung rekombinanter Produkte untersucht werden kann. Durch die Optimierung der integrativen rDNA-Sequenz aus Hansenula polymorpha wurden Vorraussetzungen geschaffen, die es den Wirtshefen ermöglichten, hohe Kopienzahlen linearisierter Plasmidsequenzen zu integrieren. Dadurch wurde ein eventueller Selektionsnachteil für die rekombinanten Stämme, durch Disruption von rDNA-Einheiten, auf ein Minimum reduziert. Die für H. polymorpha etablierte Methode der Kointegration verschiedener Expressionsvektoren, unter Verwendung eines Selektionsmarkers, konnte erfolgreich auf Arxula adeninivorans übertragen werden. Die Eigenschaft dieser dimorphen Hefe, als Myzelform hohe Proteinmengen zu sezernieren, sollte für die heterologe Genexpression genutzt werden. Es folgte die Evaluierung der Produktion pharmazeutisch interessanter sekretorischer Proteine in rekombinanten H. polymorpha- und A. adeninivorans-Stämmen. Die Produktion von rekombinantem Interferon-? (IFN-?), Interferon-? (IFN-g) und Lactoferrin wurde mit dem optimierten integrativen Vektorsystem in H. polymorpha und A. adeninivorans insbesondere unter dem Aspekt einer Sekretion der Proteine betrachtet. Bekannte Limitierungen im Vermögen von H. polymorpha diese pharmazeutischen Proteine zu sezernieren, sollten durch Überexpression verschiedener Hilfsfaktoren aus dem sekretorischen Weg behoben werden. Für diesen Zweck wurden die Hefe-Homologen zu Proteindisulfid-isomerase (PDI1), Bindeprotein (KAR2), Syntaxin (SSO2) und Calnexin (CNE1) aus Hansenula polymorpha isoliert und überexprimiert. Eine Vielzahl rekombinanter Stämme mit kointegrierten Expressionsvektoren für menschliches IFN-g, IFN-? und Lactoferrin, kombiniert mit je einem der Hilfsfaktoren aus dem sekretorischen Weg, wurden analysiert. Durch Bestimmung der Kopienzahlen integrierter Expressionskassetten wurden solche Stämme identifiziert, in denen die heterologen Genprodukte in unterschiedlichen Verhältnissen zueinander vorlagen. Durch diese Auswahl sollten eventuelle Dosis-Effekte der über-exprimierten Hilfsfaktoren in Hinblick auf eine gesteigerte Sekretion der Pharmaproteine betrachtet werden. Es konnte gezeigt werden, dass H. polymorpha und A. adeninivorans in der Lage sind IFN-? in geringen Mengen zu exprimieren. Dabei zeigte eine Überproduktion der Hilfsfaktoren in H. polymorpha keinen Einfluss auf die Produktmenge oder Sekretion des intrazellulär deponierten unvollständig glykosylierten Produkts. Lactoferrin wurde von keiner der beiden getesteten Hefen in nachweisbaren Mengen produziert. Die Überexpression von Hilfsfaktoren zeigte dabei keine Auswirkungen auf die fehlende Expression in H. polymorpha. Die in H. polymorpha mögliche IFN-?-Expression konnte in A. adeninivorans weder in Myzel- noch in Hefe-Kulturen nachvollzogen werden. Die intrazelluläre Retardierung von rekombinant produzierten IFN-g in H. polymorpha konnte durch Überexpression von endogenen CNE1 aufgehoben werden, wohingegen die drei weiteren überproduzierten Hilfsfaktoren keine Auswirkungen auf die IFN-g-Expression zeigten. Die Überproduktion des Calnexin-Homologs führte zu einer Verlagerung des unvollständig glykosylierten IFN-g in den Kulturüberstand. Dabei hatte das sezernierte Produkt ein relatives Molekulargewicht, welches dem von menschlichen IFN-g entspricht. Die bekannten Chaperon- und Lectin-Funktionen von Calnexin, zusammen mit der gezeigten Wirkung bei Überproduktion von Cne1p, könnte zur Steigerung der Sekretionseffizienz von anderen glykosylierten Proteinen in mikrobiellen Expressions-systemen herangezogen werden.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie
Dokument erstellt am:	10.12.2003
Dateien geändert am:	12.02.2007
Promotionsantrag am:	25.11.2003
Datum der Promotion:	25.11.2003