Dokument: Pyruvat-Produktion durch acetatauxotrophe Escherichia coli - Stämme

Titel:	Pyruvat-Produktion durch acetatauxotrophe Escherichia coli - Stämme
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=2671
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20031209-000671-2
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Gerharz, Tanja [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 2,34 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 09.02.2007 / geändert 09.02.2007
Beitragende:	Prof. Dr. Bott, Michael [Gutachter] Prof. Dr. Jaeger, Karl-Erich [Gutachter]
Stichwörter:	Pyruvat, E. coli, Produktion, ldhA, acetatauxotroph, DNA-Chips, 2D-Gelelektrophorese, Transkriptom-Analyse,Proteomanalysepyruvic acid, production, acetate-auxotrophic, DNA microarrays, acid stress response
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Ziel dieser Arbeit war die Konstruktion und Charakterisierung von rekombinanten Escherichia coli-Stämmen, die Glucose möglichst effizient zu Pyruvat umsetzen und dieses ins Medium ausscheiden. Als Ausgangsstamm diente E. coli YYC202, der aufgrund von Mutationen in den Genen für den Pyruvat-Dehydrogenase-Komplex (DaceEF), die Pyruvat-Formiat-Lyase (pfl-1), die Pyruvat:Chinon-Oxidoreduktase (poxB1) sowie die Phosphoenol-pyruvat-Synthetase (pps) nicht mehr in der Lage ist, Pyruvat zu Acetyl-CoA, Acetat oder Phosphoenolpyruvat umzusetzen. In dieser Arbeit konnte bestätigt werden, dass der Stamm bei Wachstum auf Glucose-Minimalmedien acetatauxotroph ist und diese Auxotrophie durch das Plasmid pGS87, welches die Gene für den Pyruvat-Dehydrogenase-Komplex trägt, komplementiert wird. Im Gegensatz zu E. coli MG1655 verstoffwechselt YYC202 Glucose und Acetat parallel und zeigt eine höhere Resistenz gegenüber Acetat als MG1655. Untersuchungen mit aerob wachsenden Kulturen von E. coli YYC202 ergaben, dass in Abhängigkeit von der eingesetzten Glucose-Konzentration, der eingesetzten Acetat-Konzentration und dem pH-Wert bis zu 1,7 Mol Pyruvat/Mol Glucose gebildet wurden. Mit nicht-wachsenden Zellen konnte eine fast vollständige Umsetzung von Glucose in Pyruvat erreicht werden (>1,9 Mol/Mol). Da bei höheren Glucose-Konzentrationen sowie bei O2-Mangel beträchtliche Mengen an Lactat als Nebenprodukt auftraten, wurde das ldhA-Gen für die NAD+-abhängige D-Lactat-Dehydrogenase inaktiviert. Im daraus resultierenden Stamm YYC202ldhA war die Lactat-Bildung vollständig eliminiert, was zu einer Steigerung der molaren Ausbeute und der Raum-Zeit-Ausbeute führte. Bei vergleichenden Transkriptomanalysen zwischen E. coli YYC202-pBR322 (Pyruvat-Produzent) und YYC202-pGS87, der aufgrund eines aktiven Pyruvat-Dehydrogenase-Komplexes kein Pyruvat bildete, zeigte sich, dass u.a. die mRNA-Level von Säurestress-Genen in YYC202-pBR322 erhöht waren. Die Pyruvat-Bildung aus Glucose führt also zu einer Ansäuerung des Cytoplasmas. Außerdem waren in YYC202-pBR322 die mRNA-Level von einigen Genen für Transportproteine erhöht, darunter der Na+/Serin-Symporter SstT und der noch nicht charakterisierte Transporter YbgH. Ob diese beiden Proteine am Import oder Export von Pyruvat beteiligt sind, muss in zukünftigen Untersuchungen geklärt werden. Da E. coli MG1655 Pyruvat und Glucose gleichzeitig als C-Quelle verwendet, muss der Pyruvat-Importer permanent aktiv sein. Versuche zur Identifizierung des entsprechenden Gens waren bisher nicht erfolgreich. Untersuchungen zum Einfluss von Inhibitoren auf die Pyruvat-Bildung durch E. coli YYC202 zeigten, dass das Protonophor Carbonylcyanid-m-chlorphenylhydrazon die Glucose-Umsetzung zu Pyruvat in Abhängigkeit vom pH stark hemmte. Dies deutet auf einen sekundär aktiven Export des Pyruvats aus der Zelle hin. Pyruvate is a central intermediate of cellular metabolism, which is also used industrially in the synthesis of a variety of compounds, e.g. L-Dopa, L-ephedrine or L-tryptophane. The aim of this work was to establish a biotechnological process for the production of pyruvate based on acetate-auxotrophic Escherichia coli strains. For this purpose, E. coli YYC202 was choosen, a strain which lacks the aceEF genes for the pyruvate dehydrogenase complex and contains mutations in the genes encoding pyruvate oxidase (poxB), pyruvate formate lyase (pflB) and PEP synthetase (pps). Due to this genotype, strain YYC202 is unable to convert pyruvate to acetyl-CoA, acetate or PEP and requires acetate for growth in glucose minimal medium. In contrast to the E. coli wild-type strain MG1655, YYC202 converted glucose and acetate simultaneously and possessed a very high acetate resistance. The acetate auxotrophy of YYC202 could be complemented in this work by transformation with plasmid pGS87, a pBR322 derivative encoding the genes of the pyruvate dehydrogenase complex. When cultivated aerobically in glucose/acetate minimal medium, E. coli YYC202 produced up to 1.7 mol pyruvate/mol glucose, depending on the concentrations of glucose and acetate and on the pH. This yield is significantly higher than the yield of 1.2 mol pyruvate/mol glucose obtained in an alternative pyruvate production process using vitamine auxotrophic microorganisms. With resting cells of E. coli YYC202, an almost complete conversion of glucose to pyruvate was obtained (>1.9 mol/mol). Formation of the by-product lactate, which occurred at higher cell densities, was entirely prevented by disruption of the ldhA gene encoding NAD+-dependent D-lactate dehydrogenase, leading to increased yields and productivity. Transriptional profiling using whole-genome DNA microarrays revealed that pyruvate production by E. coli YYC202/pBR322 is associated with acid stress. Several genes involved in the acid stress response, e.g. gadA and gadB encoding glutamate decarboxylases, had increased mRNA levels in the pyruvate producer when compared with the non-producer YYC202/pGS87. Since the external pH was 7 in these experiments, the results suggest a cytoplasmic acidification. Besides acid stress genes, the genes for the Na+/serine symporter SstT and for the not yet characterised transporter YbgH showed increased mRNA levels in the pyruvate producer. Whether these secondary transporters are involved in pyruvate import or export remains to be shown.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie
Dokument erstellt am:	09.12.2003
Dateien geändert am:	12.02.2007
Promotionsantrag am:	28.05.2003
Datum der Promotion:	28.05.2003