Dokument: Die Rolle des Homeobox-Transkriptionsfaktors TOX3 in neuralen Progenitor-Zellen und Stammzellen

Titel:	Die Rolle des Homeobox-Transkriptionsfaktors TOX3 in neuralen Progenitor-Zellen und Stammzellen
Weiterer Titel:	Role of the homoebox transcriptionfactor TOX3 in neural progenitor cells and stem cells
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=26626
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20130826-094254-3
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Kaiser, Zsuzsa [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 12,37 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 24.08.2013 / geändert 24.08.2013
Beitragende:	Prof. Dr. Methner, Axel [Betreuer/Doktorvater] Prof. Dr. Aberle, Hermann [Gutachter]
Stichwörter:	Transkriptionsfaktor, TOX3, NPC
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	TOX3 ist ein chromatin-assoziierendes Protein mit einer hoch mobilen Gruppen (HMG)-Box Domäne, bestehend aus 576 Aminosäuren, welches stromabwärts in einer zytoprotektiven Signalkaskade vorkommt, die Zellen gegen diverse Arten von Zelltod-Stimuli schützt. Der neuronale Transkriptionsfaktor wird im Gehirn, besonders in der subventrikularen Zone exprimiert, wo sich Stammzellen befinden. Ziel dieser Doktorarbeit war die Charakterisierung von TOX3 in Stammzellen und die Analyse seines Einflusses auf die Stammzellhaftigkeit. Mit Hilfe des eigens für diese Arbeit generierten N-terminalen TOX3-Antikörpers konnte gezeigt werden, dass TOX3, zusammen mit weiteren stammzellspezifischen Markern wie Nestin und Musashi1, hauptsächlich in der ganglionischen Eminenz von E13.5 Mausembryonen und daraus isolierten neuralen Progenitor Zellen (NPCs) exprimiert wird. Diese NPCs dienen als in vitro Stammzell-Modell-System, und können durch Wachstumsfaktorentzug in die Zelltypen Neuron, Astrozyt und Oligodendrozyt differenziert werden. TOX3 wurde hauptsächlich im Zellkern von undifferenzierten NPCs exprimiert, wobei nach einem Tag Wachstumsfaktorentzug eine deutliche Expressionssteigerung detektiert wurde, die mit der voranschreitenden Differenzierungsdauer wieder abnahm. Da der Notch-Signalweg als Förderer des Stammzellerhalts gilt, wurde der Einfluss von Notch-Aktivität auf TOX3-Expression untersucht. Sowohl Aktivierung des Notch-Signalweges mithilfe des Notch Liganden-Jagged als auch Inhibition durch DAPT beeinflussten die TOX3-Expression auf mRNA-Ebene, nicht jedoch auf Proteinebene. Weiter ist bekannt, dass der Notch-Signalweg die Nestin-Expression fördert. Interessanterweise führte die Überexpression von TOX3 in der neuronalen Zelllinie N2a zu einer Förderung der Nestin-Promoteraktivität, die durch Zugabe des Liganden Jagged kooperativ verstärkt und durch den Inhibitor DAPT reprimiert wurde. Diese Ergebnisse lassen den Schluss zu, dass TOX3 für den Erhalt der Stammzellhaftigkeit eine Rolle spielt. Im Gegensatz zu Notch fördert das Zytokin TGF die Differenzierung in Neurone. Durch Zugabe von TGF, wurde die TOX3-Expression auf mRNA- und Proteinebene reprimiert, was ebenfalls eine potentielle Rolle von TOX3 im Stammzellerhalt vermuten lässt. In einem Screen nach Interaktionspartnern von TOX3 wurde HDAC1 als möglicher Interaktionspartner identifiziert und eine endogene Interaktion zwischen HDAC1 und TOX3 konnte verifiziert werden. HDAC1 gehört zur Klasse I der Histondeacetylierungsproteine und bewirkt durch potentielle Deacetylierung von Zielgenen/Faktoren die Reprimierung der Transkription. Die Zugabe des HDAC-Inhibitors Trichostatin A (TSA) führte in einer konzentrationsabhängigen Weise zu einer Reduktion von endogenem TOX3, zu einem geringen Zellsterben, sowie zu einer Reduktion der Nestin-Promoteraktivität in N2a-Zellen, möglicherweise verursacht durch seine zytotoxische bzw. wachstumsinhibierende Eigenschaft auf Zellen. Des Weiteren wurde die Rolle von TOX3 auf die Tumorigenität von Krebs-Stammzellen untersucht. Hierfür wurden Glioblastom-stammzellähnliche Zelllinien auf ihre TOX3-Expression untersucht. Dabei konnte ein hohes Vorkommen in den invasiven Glioblastom-Zelllinien GS8 und GS9 detektiert werden, im Gegensatz zur nicht-invasiven GS7-Linie. Stabile TOX3-Expression in der GS7-Linie führte zu einer Reduktion der Proliferation bzw. der metabolischen Aktivität, vergleichbar zu den endogen TOX3-exprimierenden GS8 und GS9 Linien. Durch TOX3-Herunterregulierung in der GS8-Linie konnte dieser Effekt allerdings nicht aufgehoben werden. Der Einfluss von TOX3 in der nicht invasiven Glioblastom-Linie GS7 führte indessen zu einer reduzierten Neurosphären- bzw. Aggregatsbildung, was vermutlich durch veränderte Zusammensetzung der extrazellulären Matrix zustande kommt. Zusammenfassend konnten wichtige Einblicke in die Funktion von TOX3 in Zelltypen mit Stammzellcharakter gewonnen werden. In der frühen Embryogenese ist TOX3 am Erhalt von Stammzellen beteiligt, da es hauptsächlich in proliferierenden NPCs vorkommt, mit der Nestin-Expression korreliert und mit HDAC1 interagiert. In Glioblastom-Zelllinien kommt TOX3 in besonders invasiven, stammzellähnlichen Populationen vor, verringert hier die Metabolierungsrate und verändert die Neigung zur Sphärenbildung, was auf einen Einfluss von TOX3 auf die extrazelluläre Matrix schließen lässt. TOX3 is a chromatin-associated protein with a high-mobility group (HMG)-box domain, consisting of 576 amino acids and is expressed downstream of a cytoprotective signaling cascade, which protects cells against different cell death stimuli. The neuronal transcription factor is expressed in the brain, especially in the subventricular zone where neural stem cells prevail. Aim of this doctoral thesis was the characterization of TOX3 in stem cells and the analysis of its potential influence on the stem-cell-ness. With an n-terminal TOX3-antibody, generated exclusively for this thesis, TOX3 expression was observed, together with the stem-cell markers Nestin and Musashi1, predominantly in the ganglionic eminence of E13.5 mice embryos and in neural precursor cells (NPCs) isolated from there. These NPCs derived from the ganglionic eminence serve as in vitro stem-cell model system and can be differentiated into neurons, astrocytes and oligodendrocytes by growth factor deprivation. TOX3 was mainly expressed in the nucleus of undifferentiated NPCs, showed a significant increase in expression 24h after growth-factor deprivation and a subsequent decrease during further differentiation Since the notch pathway promotes the maintenance of stem-cell-ness, I next investigated the impact of notch activity on TOX3 expression. Both, activation of notch signaling with the notch ligand jagged as well as inhibition with DAPT influenced TOX3-expression on mRNA, but not on protein level. Further it is known that the notch pathway enhances nestin expression. Interestingly, overexpression of TOX3 in the neuronal N2a cell line led to increased nestin promoter activity, which was cooperatively enhanced through treatment with the ligand jagged and repressed by treatment with the inhibitor DAPT. These results suggest that TOX3 is involved in the maintenance of the stem-cell-ness. In contrast to notch the cytokine TGF promotes the differentiation into neurons. By treatment with TGFβ TOX3 expression was repressed on mRNA and protein level, which again argues for its role in the maintenance of the stem-cell-ness. In a screen for interaction partners of TOX3 HDAC1 was identified and the interaction between endogenous HDAC1 and TOX3 could be verified. HDAC1 belongs to the class I of the histon-deacetylase proteins, which deacetylate target genes or factors to repress their transcription. Treatment with Trichostatin A (TSA), an inhibitor of HDACs class I and II, led to a reduction of endogenous TOX3 in a concentration-dependent manner, to a reduction of nestin-promoter activity in N2a cells and to slight cell death, probably caused by cytotoxic and growth inhibitory effects of TSA. In order to examine the role of TOX3 on tumorigenicity of cancer-stem cells, stem-cell like glioblastoma cell lines were analyzed for their TOX3 expression. TOX3 was highly expressed in the invasive GS8 and GS9 cell lines, in contrast to the non-invasive GS7-line. Stable TOX3-expression in the GS7-line resulted in an inhibition of proliferation or reduced metabolic activity, similar to the endogenously TOX3 expressing GS8 and GS9 cell lines. TOX3 knock down in the GS8 cell line was not able to revert this effect. The influence of TOX3 in the non-invasive GS7 line led to a reduced formation of neurospheres or aggregates and inhibited proliferation, probably caused by an altered composition of the extracellular matrix. In summary, I could win important insights into the function of TOX3 in different cell types with stem cell character. During early embryogenesis TOX3 is involved in the maintenance of stem-cell-ness, because it is predominantly expressed in proliferating NPCs, correlates with the expression of nestin and interacts with HDAC1. Whereas in stem-cell like glioblastoma cells TOX3 is strongly expressed in invasive populations, reduces the metabolic rate and changes the tendency of the cells to form spheres, what hints to a possible influence of TOX 3 on extracellular matrix composition.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie
Dokument erstellt am:	26.08.2013
Dateien geändert am:	26.08.2013
Promotionsantrag am:	27.05.2013
Datum der Promotion:	10.07.2013