Dokument: Cornichon: An ancient ER cargo exporter is recruited to serve as an AMPA receptor auxiliary subunit

Titel:	Cornichon: An ancient ER cargo exporter is recruited to serve as an AMPA receptor auxiliary subunit
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=26500
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20130812-122142-7
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Mauric, Veronika [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 4,58 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 12.08.2013 / geändert 12.08.2013
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Verschiedene Orthologe der hochkonservierten Familie der Cornichon Proteine (CNIH) exportieren transmembranäre Vorläuferformen von Wachstumsfaktoren sowie bestimmte Typ-1 Transmembranproteine aus dem endoplasmatischem Retikulum (ER). In einer Proteomanalyse sind darüber hinaus die Säugetier-Homologe CNIH-2 und CNIH-3 als Bestandteile nativer Glutamatrezeptorkomplexe vom AMPA-Subtyp im zentralen Nervensystem (ZNS) der Ratte identifiziert worden (Schwenk et al, 2009). Experimente in heterologen Expressionssystemen haben gezeigt, dass die Koexpression von CNIH-2/3 die Anzahl der AMPA-Rezeptoren an der Zelloberfläche (Oberflächenexpression) erhöht und die elektrophysiologischen Eigenschaften des AMPA-Rezeptors moduliert. Ziel der vorliegenden Arbeit war (1) die Identifizierung der molekularen Mechanismen, die der erhöhten Oberflächenexpression der AMPA-Rezeptoren bei Koexpression von CNIH-2/3 zugrunde liegen und (2) die Charakterisierung des ontogenetischen Expressionsprofils von CNIH-2/3 im ZNS der Ratte. Mittels Immunzytochemie wurde CNIH-2 im frühen sekretorischen Transportweg, d. h. im ER und Golgi-Apparat nachgewiesen. Funktionelle Experimente konnten zeigen, dass CNIH-2 den Export von AMPA-Rezeptoren aus dem ER in einem COPII-abhängigen Mechanismus fördert und dadurch die Oberflächenexpression der Rezeptoren erhöht. Durch Interaktion mit dem AMPA-Rezeptor verlässt CNIH-2 seine ursprüngliche subzelluläre Lokalisation und gelangt zusammen mit den Rezeptoren zur Plasmamembran. Dort verbleibt es im Rezeptorkomplex und verändert dessen biophysikalische Eigenschaften. Die ontogenetischen Expressionsprofile von CNIH-2 und CNIH-3 wurden auf Ebene der mRNA mittels nicht-radioaktiver in-situ Hybridisierung und auf Ebene der Proteinexpression mittels Immunblot-Analyse charakterisiert. Sowohl auf Ebene der mRNA- als auch Protein-Expression zeigten CNIH-2/3 eine besonders starke Expression in der frühen Ontogenese, die mit zunehmendem Alter abnahm. Dagegen verhielten sich die porenbildenden AMPA-Rezeptor Untereinheiten GluA1-4 und auch ihre prototypischen Hilfsuntereinheiten, wie die Transmembrane AMPA-receptor Regulatory Proteins (TARPs) genau entgegengesetzt. Ihre Expression nahm im Entwicklungsverlauf zu. Depletierende Ko-Immunpräzipitationen der porenbildenden AMPA-Rezeptor-Untereinheiten GluA1-4 offenbarten, dass CNIH-2/3 im Verlauf der Entwicklung in gleich bleibender Stöchiometrie in AMPA-Rezeptorkomplexe integriert ist. Somit verbleibt in der frühen Ontogenese ein signifikanter Anteil an CNIH-2/3, der nicht mit AMPA-Rezeptoren interagiert. Dieser AMPA-Rezeptor-freie Anteil an CNIH-2/3 steht für andere Funktionen als die einer AMPA-Rezeptor Hilfsuntereinheit zur Verfügung. Zusammengefasst zeigt die folgende Arbeit, dass CNIH-2/3 sowohl als ER Frachtexporter fungieren als auch – bei Anwesenheit von AMPA-Rezeptoren - als deren Hilfsuntereinheit in Rezeptorkomplexe an der Zelloberfäche rekrutiert werden. Die reziproken Expressionsprofile der porenbildenden AMPA-Rezeptoren-Untereinheiten und CNIH-2/3 bei jedoch unveränderter anteiliger Zusammensetzung der Rezeptorkomplexe während der Ontogenese deuten auf eine zusätzliche Funktion von CNIH-2/3 – z. B. als ER Frachtexporter von Wachstumsfaktoren – während der frühen Entwicklung hin. The cornichon (CNIH) family of proteins is highly conserved among species. Orthologs serve as ER cargo exporters for precursors of growth factors of the EGF superfamily and other single pass transmembrane proteins. Recently, using a proteomic based approach, the mammalian cornichon homologues CNIH-2 and CNIH-3 have been identified as constituents of native glutamate receptors of the AMPA subtype (AMPARs) in rat brain. Heterologous reconstitution experiments have shown that CNIH-2/3 increase AMPAR levels at the plasma membrane and modulate the biophysical properties of the channel (Schwenk, Harmel et al. 2009). This work aimed to elucidate the molecular mechanism underlying the increase in the surface population of AMPARs and to characterize the ontogenetic expression pattern of CNIH-2/3 in rat brain. Using immunocytochemistry, the results show that CNIH-2 usually resides within the early secretory pathway. Functional studies demonstrate that CNIH-2 facilitates the delivery of AMPARs via COPII dependent ER export, thereby increasing the plasma membrane population of AMPARs. The interaction of CNIH-2 and AMPAR forces CNIH-2 to leave its ancestral localization and to accompany the AMPAR to the plasma membrane where it remains within the channel complex to alter the signaling properties of the AMPAR. Developmental expression profiles of CNIH-2 and CNIH-3, assessed at mRNA level by non-radioactive in-situ hybridization and at protein level by immunoblot analysis, exhibit elevated expression in late embryogenesis and a decline in expression towards adult stage. Surprisingly, the pore-lining AMPAR GluA subunits as well as prototypical auxiliary subunits as the transmembrane AMPAR regulatory proteins (TARPs) show an expression pattern reciprocal to the one of CNIH-2/3. Co-immunoprecipitation analysis, however, reveals that CNIH-2/3 integrate into AMPAR complexes at similar ratios both at embryonic and adult stage of development. Thus, there is a large pool of AMPAR-free CNIH-2/3 in early development, which might serve other roles than being an AMPAR auxiliary subunit. In summary, the present study shows that CNIH-2/3 operates both as an ER cargo exporter and, if AMPARs are present, as their auxiliary subunit. Given the reciprocal expression profiles of CNIH-2/3 and the pore-forming GluAs but their constant ratio of co-assembly during ontogenesis, the data strongly suggest that in early development, CNIH-2/3 fulfills functions in addition to being an AMPAR constituent, i.e. ER cargo export of growth factors.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Medizinische Fakultät » Institute » Institut für Neuro- und Sinnesphysiologie
Dokument erstellt am:	12.08.2013
Dateien geändert am:	12.08.2013
Promotionsantrag am:	24.06.2013
Datum der Promotion:	14.07.2013