Dokument: Funktionelle Analyse neuer mitotischer Regulationsmechanismen in Schizosaccharomyces pombe

Titel:	Funktionelle Analyse neuer mitotischer Regulationsmechanismen in Schizosaccharomyces pombe
Weiterer Titel:	Functional analysis of novel mitotic regulatory mechanisms in Schizosaccharomyces pombe
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=26269
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20130715-150831-9
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Topolski, Boris [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 17,01 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 15.07.2013 / geändert 15.07.2013
Beitragende:	PD Dr. Fleig, Ursula [Gutachter] Prof. Dr. Westhoff, Peter [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Der Zugewinn oder Verlust einzelner Chromosomen oder Genabschnitte wird von der Natur nur selten toleriert. Diese Aneuploidienmanifestieren sich oft als beeinträchtigte Fitness einzelner Zellen oder ganzer Organismen.Maligne Tumore, welche durch die Akkumulation aneuploider Zellen geprägt sind, haben durch ihren unkontrollierten Stoffwechsel und ihre rapide Teilungsfähigkeit zwar einen Überlebensvorteil gegenüber benachbarten Zellverbänden, sind aber durch den Funktionsverlust von Geweben letztendlich letal für den Organismus. Aneuploide Zellen werden heute als Auslöser füreine Vielzahl von Krebsarten, neurodegenerativen Erkrankungen sowie vorzeitiger Zellalterung diskutiert. Doch wie entsteht Aneuploidie, also der Verlust oder Zugewinn ganzer Chromosomen oder Genabschnitte? Viele Studien zeigen, dass Fehler während der Mitose wie eine inkorrekte Verbindung der Spindelfasern mit den Chromosomen, ein aberranter Aufbau der Spindel oder ein funktionsloser Spindelkontrollpunkt zu aneuploiden Zellen führen können. Von besonderem Interesse ist hier einMultiproteinkomplex, der Kinetochor, welcher auf dem Zentromer-Chromatin assembliert und die Mitose reguliert. Die wichtigstenKinetochorproteine bilden zwei evolutionär konservierteKinetochor-Großkomplexe, welche in unserem Modellsystem der SpalthefeSchizosaccharomyces pombe als NMS- und Sim4-Komplex bezeichnet werden. Die 13 Proteine des Sim4-Komplexes bildendurch die Rekrutierung weiterer Proteine ein komplexes Netzwerk, welchesfür die Aufrechterhaltung der speziellen Chromatin-Struktur des Zentromers, die Verbindung der Chromosomen mit der mitotischen Spindel, sowie die Qualitätskontrolledieser Verbindungen benötigt wird.Die zugrundeliegenden Regulationsmechanismen welche beschreiben,wie die Feinabstimmung dieser Prozesse durch den Sim4-Komplex erfolgt,sind bisher kaum verstanden. In dieser Arbeit war es mir möglichzwei neue Komponenten zu charakterisieren, welchedurch spezifische Wirkweisen auf den Sim4-Komplex,die Regulation mitotischer Prozesse vermitteln.Dabei handelt es sich zum einen um die Asp1 Proteinkinase, zum anderen um denS. pombe Translations-Initiations-Faktor 1, Sui1. Meine Analysen zeigen, dass diese beiden Proteine die Funktionsweise des Sim4-Komplexes in unterschiedlicher und wahrscheinlich nicht voneinander abhängiger Weise regulieren. Das Asp1 Protein ist ein Mitglied der hochkonservierten eukaryotischen Vip1-Familie der 1/3-Inositolpolyphosphatkinasen, welche kleine ringförmige Signalmoleküle, sogenannte Inositolpolyphosphate (IPs) generieren.Proteine dieser Familie weisen eine charakteristische Zwei-Domänen Struktur auf, bestehend aus einer N-terminalen Kinasedomäne und einer C-terminalen Domäne, welche Homologie zu sauren Histidin-Phosphatasen aufweist. Ausgehend vom IP6 wird durch die katalytische Aktivität der Kinasedomäne IP7generiert. Unsere Arbeitsgruppe konnte zeigen, dass diese enzymatische Aktivität negativ durch die C-terminale Phosphatasedomäne reguliert wird. Durch Lebendzellfluoreszenz-Analysen von Hefe-Stämmen, welche Asp1 Varianten exprimieren, die kein oder mehr als die wild-typische Menge von IP7 generieren,konnte ich zeigen, dass Inositolpolyphosphate drei mitotische Komponenten regulieren: (1) Die Kinetochor-Lokalisation der Sim4-Kinetochor-Komplex-Komponenten Mal2 und Fta2 wird durch IP7 moduliert. Erhöhte Mengen an IP7 führen zu einer verminderten Kinetochor-Lokalisation dieser Proteine, während Abwesenheit von IP7zu einer stärkeren Lokalisation dieser Proteine führt. Genetische Analysen zeigen, dass möglicherweise auch andere Sim4-Komplex-Komponenten durch diese Signalmoleküle reguliert werden. (2) Die Stabilität und Dynamik der mitotischen Spindel wird durch Asp1 generiertes IP7 moduliert. Verlust von Asp1 generiertem IP7resultiert in instabilen Spindelmitten, welche zu brechenden Metaphasenspindelnführen können. Erhöhte IP7Mengen haben dagegen einen stabilisierenden Einfluss auf die mitotische Spindel. Die Elongationsgeschwindigkeit der mitotischen Spindel in der Prometaphase und der Anaphase B wird ebenfalls durch die Menge an IP7 beeinflusst. (3) Der Übergang von der Metaphase in die Anaphase A wird durch die Menge an Asp1 generiertem IP7 moduliert. Verlust von IP7 führt zu einem transienten Arrest in der Metaphase, wohingegen hohe IP7Mengen dazu führen, dass die Zelle die Metaphase schneller durchläuft. Weitere Daten deuten auf eine spezifische Funktion von Asp1 für die Aktivität des mitotischen Spindelkontrollpunktes hin, welcher den Übergang von der Metaphase in die Anaphase A kontrolliert. Ein zweiter Regulator des Sim4-Komplexes ist das Sui1 Protein.Das sui1+ Gen wurde in unserer Arbeitsgruppe als Multikopien Suppressoreines Sim4-Komplex-Mutantenstammes isoliert.Bei Sui1 handelt es sich um denS. pombe Translations-Initiations-Faktor 1, welcher in höheren Eukaryonten alsKomponente des 48S Präinitiationskomplexes für die korrekte Erkennung des AUG-Kodons einer mRNA benötigt wird. Überexpression von sui1+ supprimiert exklusivSim4-Komplex-Mutantenstämme. Überexpression von sui1+ verstärkt die transkriptionelle Stilllegung der inneren Zentromerregion, deren Struktur durch den Einbau Zentromer spezifischer Nukleosomen vermittelt wird, welche die Histon H3 Variante CENP-A/Cnp1 beinhalten. Extra sui1+erhöht die zelluläre Proteinmenge wie auch die Kinetochor-Lokalisation des Mal2 Proteins. Überexpression eines Sui1 Antagonisten, des Translations-Initiations-Faktors 5 (eif5+) reduziert dagegen die Mal2 Proteinmenge. Diese Daten deuten drauf hin, dass die Proteinmenge von Komponenten des Sim4-Kinetochor-Komplexes durch einen neuen Regulationsmechanismus auf Ebene der Translations-Initiation kontrolliert wird. The gain or loss of individual chromosomes or gene fragments is poorly tolerated by nature. Aneuploidy is often manifested as impaired fitness of individual cells or whole organisms. Malignant tumors are characterized by the accumulation of aneuploid cells and an uncontrolled metabolism. However the survival advantage of these rapidly dividing cells in comparison tonearby groups of cells can lead to a functional loss of tissues thus being lethal for the organism.Aneuploid cells are discussed to cause a variety of cancers, neurodegenerative diseases, and premature cellular aging. But how does aneuploidy meaning the gain or loss of whole chromosomes occur? Many studies show that mitotic defects such as the incorrect connection of the spindle fibers to the chromosomes, an aberrant spindle structure or the functional loss of the spindle checkpoint can lead to aneuploidy. Consequentlykinetochores which assemble on centromeric chromatin and regulate mitosis are of particular interest. The most important kinetochore proteins form two evolutionary conserved kinetochore complexes referred to as the NMS- and the Sim4-complex in the fission yeastSchizosaccharomyces pombe.The 13 componentSim4-kinetochore-complexrecruitsother kinetochore components therebyforming a complex networkrequired for the maintenance of the specialcentromeric chromatin structure, thebinding of chromosomes to spindle microtubules and the quality control of the spindle-kinetochore connection. The underlying regulatory mechanisms describing the fine tuning of Sim4 complex specific mitotic events are poorly understood. This work represents the characterization of two novel components mediating a Sim4 complex specific regulation of mitotic processes. These componentsare the Asp1 protein kinase and the S. pombe translation initiation factor 1 Sui1. These proteins appear to regulate the Sim4-kinetochore-complex in an independent manner.The Asp1 protein is a member of the highly conserved eukaryotic Vip11/3 inositol polyphosphate kinase family generating small circular signal molecules called inositol polyphosphates (IPs). Members of this family are characterized by a specificdual domain structure consisting of a N-terminal kinase domain and a C-terminal domain which has homology to histidine acid phosphatases. Using IP6as a substrate the catalytic activity of the kinase domain generates IP7. Our group has shown that this enzymatic activity is modulated negatively by the C-terminal part of the protein. I could identify diverse roles of inositol polyphosphates during mitosis with the help ofmitotic yeast cells expressing Asp1 variants that generated no or more than the wild-type amount of IP7: (1) Kinetochore localization of Sim4 complex components Mal2 and Fta2 is modulated by IP7. Increased IP7amounts lead to decreased kinetochore localization of these proteins, whereas the absence of IP7boosts kinetochore localization of Mal2 and Fta2. Genetic analysis indicates that possibly other Sim4 complex components are also regulated by these signaling molecules. (2) Spindle stability and dynamic is modulated by Asp1 generated IP7. Unstable spindle mid-zones due to loss of IP7can lead to metaphase spindle breakage. In contrastincreased IP7 amounts stabilize the mitotic spindle overlap zones. Furthermore the amount of IP7affects the spindle elongation rate in pro-metaphase and anaphase-B. (3) The metaphase to anaphase-A transition is modulated by Asp1 generated IP7. Loss of IP7results in atransient metaphase arrest, whereas high amounts lead to cellsthat pass faster through metaphase.Additional data suggest a specific Asp1 function for mitotic spindle checkpoint activity which controls the metaphase toanaphase-A transition. The Sui1 protein represents the second regulator of the Sim4-kinetochore-complex characterized in this work. In our lab the sui1+ gene was isolated as a multi-copy suppressor of a Sim4-complex mutant strain. Sui1 known as the S. pombe translation initiation factor 1 is part of the 48S pre-initiation complex being responsible for start codon recognition of mRNAs in higher eukaryotes.sui1+ overexpression suppresses exclusively Sim4 complex mutant strains. Transcriptional silencing of the inner centromere which is maintained by the incorporation of nucleosomes containing the histone H3 variant CENP-A/Cnp1 is increased by overexpressing sui1+. Furthermore Mal2 protein level and its kinetochore localization isenhanced by sui1+ overexpression. However overexpression of thesui1+ antagonist eif5+ reduces the Mal2 protein level. Thus the protein level of Sim4-kinetochore-complex componentsappears to be controlled by a regulatory mechanism at translation initiation.
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Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Funktionelle Genomforschung der Mikroorganismen
Dokument erstellt am:	15.07.2013
Dateien geändert am:	15.07.2013
Promotionsantrag am:	13.05.2013
Datum der Promotion:	20.06.2013